貝類の高度な環境順応は新たなエネルギー節約系が関与する

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660196
• Research Institution: Ishikawa Agricultural College
• Principal Investigator: 榎本 俊樹 石川県農業短期大学, 食品科学科, 教授 (70203643)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久田 孝 石川県農業短期大学, 食品科学科, 助教授 (00290081)
• Keywords: ホタテ貝 / ホスホフルクトキナーゼ / PFK / 嫌気代謝 / オピン発酵

Research Abstract

ホタテ貝閉殻筋より粗酵素液を調製し、DEAEトヨパール、ブチルトヨパール、セファロース6Bクロマトグラフィーを用いて、PFKの精製を行った。得られた標品は蛋白的に均一で、SDS-PAGE及びセファロース6Bクロマトグラフィーの結果から、分子量98,000のサブユニットよりなる4量体であった。次いで、精製標品の酵素化学的性質について検討を行った結果、ホタテ貝PFKはATPのみならずADPをもリン酸供与体として利用することが明らかとなった。ATP、ADPに対するKm値はそれぞれ、0.048mM、0.036mMと算出され、ADPに対する親和性がATPのそれより高いことが判明した。また、ATP、ADPいずれの基質を用いた場合でも、フルクトース2,6,ビスリン酸により最大反応速度が増加し、高濃度の基質による活性阻害が解除された。一方、フルクトース6リン酸に対する親和性は、リン酸供与体としてATP、ADPを用いた場合では異なり(ATP、ADPを用いた場合では、それぞれ0.18mM、0.068mM)、ADPを用いた場合のほうが高かった。ATP、ADPいずれを用いた場合でも、フルクトース2,6ビスリン酸によりフルクトース6リン酸に対する親和性及び最大反応速度が顕著に増加した。さらに、活性部位の構造を明らかにする目的で、ホタテ貝閉殻筋PFKの全塩基配列決定を試みた。すなわち、ホタテ貝閉殻筋より抽出したmRNA,から逆転写反応によって作成したcDNAをテンプレートとして、精製標品をトリプシン消化し得られたペプチド断片やN末端のアミノ酸配列から作成したプライマーを用いてPCRを行った。増幅されたDNA断片をクローニングし、大腸菌を形質転換して、ホタテ貝PFKの部分塩基配列を決定した。全塩基配列については現在、検討中である。