遺伝子クローニングを用いた魚類筋原線維結合型セリンプロテアーゼの構造・機能の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660203
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 原 研治 長崎大学, 水産学部, 教授 (10039737)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長富 潔 長崎大学, 水産学部, 助教授 (40253702) ; 橘 勝康 長崎大学, 水産学部, 助教授 (20171712) ; 石原 忠 長崎大学, 水産学部, 教授 (40039722)
• Keywords: 筋原線維結合型セリンプロテアーゼ / 火戻り / 精製 / N末端アミノ酸配列 / プローブ / 遺伝子クローニング

Research Abstract

魚類筋原線維由来セリンプロテアーゼは、魚肉の利用加工はもとより、筋肉タンパク質の代謝にも密接に関連する興味深い酵素であるにもかかわらず,精製が非常に困難である
本年度は、これまで精製方法が確立しているコイを用いてN末端アミノ酸配列を決定し、クローニングのためのプローブを設計することを主眼とした。
「MBPの精製」コイ普通筋から筋形質画分を充分に除去した筋原線維画分を得る。この画分に3倍量の2MKClを加え筋原線維タンパクを溶解する。この溶液をpH4.0に調整し2時間放置することで初めて本酵素は可溶化される。この粗酵素をSephacryl S-300及びUltrogel AcA 54によるゲルろ過、Arginine-Sepharoseによるアフィニティクロマトを用いて精製した。最終的に本酵素は粗酵素から約10,000倍に精製され、回収率は約17%であった。
「MBSPのN末端アミノ酸配列決定」コイMBSPのN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーにて解析したところ、40残基まで決定した。コイMBSPはセリンプロテアーゼでよく保存されているCR-1,CR-2の保存領域を含み、ヒトメクラチン、トリプターゼ、ヘプシンや牛トリプシンのようなトリプシン型酵素とホモロジーが高かった。また40番目のHisは活性中心のHisと考えられた。
このデータからセンスプライマーを、セリンプロテアーゼに良く保存されている活性中心のアミノ酸配列を基にアンチセンスプライマーを設計した。全RNAはコイ筋肉からISOGEN(日本ジーン社製)を用いて抽出した。現在、これからmRNAを精製し、逆転写酵素でcDNAライブラリーを作成したところである。次年度、これを鋳型として、RT-PCR法、5'および3'RACE法を用いてコイMBSP遺伝子クローニングを行い、全一次構造を明らかにしたい。