2002 Fiscal Year Annual Research Report
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13670103
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
北川 香織 関西医科大学, 医学部, 助手 (10165813)
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| Keywords | 塩素イオンポンプ / ラット脳細胞膜 / ClP55 / 親和性カラム / GSTrap FFカラム / ATPase |
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| Research Abstract |
1.55kDa(ClP55)以外の塩素イオンポンプサブユニットcDNAのクローニングラット脳より細胞膜面分を可溶化し、CMセファロース、MonoQカラムによるHPLC分離後、塩素イオンポンプ/ATPasc活性を保持する分画を用いて、以下の方法によるClP55以外の塩素イオンポンプサブユニットを検索した。
(1)抗体結合による方法
抗GST-ClP55組換え蛋白質に対する特異抗体を結合した親和性カラムを作成し、上記の塩素イオンポンプ粗抽出分画を吸着後、溶出した。得られたサンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写後、膜のCBB染色を行なった結果、ClP55以外の蛋白質は、5種類(72,62,51,49,46kDa)存在することが明らかになった。
(2)蛋白結合による方法
GST-ClP55組換え蛋白質をGSTrap FFカラムに結合した親和性カラムを作成し、上記の塩素イオンポンプ粗抽出分画を吸着後、溶出した。得られたサンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写後、膜のCBB染色によって、ClP55以外の蛋白質は3種類(62,51,49kDa)存在することが明らかになった。
2.ClP55とATPase蛋白との結合性の確認
上記の塩素イオンポンプ粗抽出分画をATP結合カラムに吸着させ、ATP溶液で溶出した。得られたサンプルをSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜に転写後、抗ClP55抗体によって検出したところ、ATPasc蛋白とともにClP55が存在することが明らかになった。
以上に結果から、塩素イオンポンプは、ClP55を含めて少なくとも4種類の異なった蛋白質より成ることが明らかとなった。
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[Publications] Kyoko Yagyu: "Protective effects of estradiol against amyloid β protein-induced inhibition of neuronal CI-ATPase activity"Neuropharmacology. 43・8. 1297-1304 (2002)
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[Publications] Bo Wu: "Phosphatidylinositol and PI-4-monophosphate recover amyloid β protern-induced inhibition of CL-ATPase activity"Life Sci.. 72・4-5. 455-463 (2002)
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[Publications] Kaori Kitagawa: "Molecular Cloning and Characterization of CP Pump-associated 55 kDa Protein in Rat Brain"Biochem. Bioph. Res. Co.. 289・2. 363-371 (2001)
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[Publications] Kyoko Yagyu: "Amyloid β proteins inhibit CF-ATPase activity in cultured rat hippocampal neurons"J. Neurochem.. 78・3. 569-576 (2001)
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[Publications] Xun-Ting Zeng: "Developmental changes in CL-ATPase activity in rat brains"Neurosci. Lett.. 302・2-3. 101-104 (2001)
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[Publications] Chiyoko Inagaki: "Cl^--ATPase in rat brain and kidney"J. Exp. Zool.. 289・4. 224-231 (2001)
