GPIアンカー型GFPを用いたGPIアンカー型蛋白質遊離メカニズムの解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670118
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 近藤 玄 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (40243258)
• Keywords: GPIアンカー / GFP / 胎盤型アルカリフォスファターゼ / マウス / 精巣 / 生殖細胞 / 遊離因子 / 精製

Research Abstract

GPIは、アルカリフォスファターゼ、プリオン、CEA等多岐にわたる機能分子の細胞内輸送や細胞膜アンカーに必須の糖脂質である。これらのGPIアンカー型蛋白質は、細胞膜上にとどまるばかりでなく、細胞外に放出されることが知られているが、その遊離メカニズムや生理的意義はよくわかっていない。我々が樹立したGPIアンカー型GFP(EGFP-GPI)トランスジェニックマウスでは、膵臓・顎下腺・精嚢等の外分泌腺や精巣において、EGFP-GPIの分泌が認められた。本研究では、GPIアンカー型蛋白質遊離に関わる因子の同定を行う。これにより、GPIアンカー型蛋白質の遊離メカニズムおよびその生理的意義が明らかになると期待される。また、GPIアンカー型蛋白質遊離因子が同定され構造が決定されれば、疾患との関連性も解明できると考えられる。まず、我々は、胎盤型アルカリフォスファターゼおよびEGFP-GPIのふたつのレポーター分子の細胞膜画分からの遊離を指標とする酵素アッセイ系を構築した。次に、マウス精巣500個より、生殖細胞分画約30gを得、膜分画抽出液をDEAE-セファロース陰イオン交換、フェニールセファロースHIC、ConAアフィニティー、ゲルろ過HPLCの各液体クロマトグラフィーに段階的にかけ、酵素活性を担う単一バンドを得た。そして、この分子について現在までに以下の性質が判明した。
(1)膜結合蛋白質である。
(2)Ca依存性の酵素活性がある。
(3)糖蛋白質である。
(4)SDS-PAGEでの分子量は約100kDaである。
現在、この分子の構造決定および遺伝子クローニングを行っている。

Research Products

• [Publications] Kawane, K: "Requirement of DNase II for defenitive erythropoiesis in the mouse fetal liver"Science. 292. 1546-1549 (2001)
• [Publications] Horie, K: "Efficient chromosomal tranceposition of a Tcl/mariner-like transposon Sleeping Beauty in mice"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. 9191-9196 (2001)