活性酸素種・NOによる増殖因子誘導とプロセシングを介した動脈硬化発症機序の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670151
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 鈴木 敬一郎 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (70221322)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 幸洋 兵庫医科大学, 医学部, 助手 (60330453) ; 大河原 知水 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (50330452)
• Keywords: 一酸化窒素 / 動脈硬化 / 過酸化物 / HP-EGF / 血管平滑筋 / JNK

Research Abstract

一酸化窒素(NO)は血管拡張、神経伝達など多彩な生理作用のある一方、peroxynitriteを介して細胞障害性も有し、血管系に対し酸化ストレスを与える。一方、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB-EGF)は血管平滑筋細胞で発現し、動脈硬化に関与する事が知られている。そこで今年度は血管平滑筋細胞においてNOによる酸化ストレスのメカニズムとHB-EGF誘導のメカニズムについて検討を加えた。
血管平滑筋細胞はラット大動脈より単離、継代培養し実験に用いた。ラット血管平滑筋細胞にNOドナーを添加し、ノーザンプロツト法ならびにウエスタンプロット法によりHB-EGFの発現誘導の検討した。その結果N-ニトロソアセチルペニシルアミン(SNAP)、ペルオキシ亜硝酸(peroxynitrite)などによりHB-EGFの著明な発現誘導を認めた。
グルタチオンペルオキシダーゼは細胞内の過酸化水素ならびに過酸化脂質除去の中心的な酵素であるが、SNAPをラット血管平滑筋細胞に添加したところグルタチオンペルオキシダーゼ不活性化された。また過酸化物のprobeであるH2DCFを用いてFACSで解析すると細胞内の過酸化物の蓄積が認められた。これらによりNOによる酸化ストレスは、抗酸化酵素の不活性化を介して結果的に過酸化物が蓄積し細胞障害をもたらすというメカニズムが示唆された。
NOによるHB-EGFの発現誘導経路について検討をしたところ、HB-EGFの発現誘導はc-Jun N-terminalキナーゼ1(JNK1)のdominant-negative mutantで阻害された。さらにNOによるJNKの活性化とHB-EGFの発現誘導がカタラーゼ、N-アセチルシステイン(NAC)で阻害された。これらの結果よりNOによる過酸化物の蓄積はJNKを活性化しHB-EGFの発現を誘導することが示唆された。

Research Products

• [Publications] Koh YH, et al.: "Inactivation of glutathione peroxidase by NO leads to the accumulation H_2O_2 and the induction of HB-EGF via c-Jun NH_2-terminal kinase in rat aortic smooth muscle cells"FASEB J.. 15. 1472-1474 (2001)
• [Publications] Koh YH, et al.: "Osmotic stress induces HB-EGF gene expression vis Ca2+/JNK signal cascades in rat aortic smooth muscle cells"J Biochem. 130. 351-358 (2001)
• [Publications] Obata H, et al.: "Dye terminator re-cycle-sequencing method : Phage plaque direct sequencing"Analytical Biochem. 272. 102-105 (2001)
• [Publications] Kizaki T, et al.: "Negative Regulation of LPS-Stimulated Expression of inducible Nitric Oxide Synthase by AP-1 in Macrophage Cell Line J774A.1"Biochem Biophys Res Commun.. 289. 1031-1038 (2001)
• [Publications] Koh YH, et al.: "Inactivation of glutathione peroxidase by NO leads to the accumulation H_2O_2 and the induction of HB-EGF via c-Jun NH_2-terminal kinase in rat aortic smooth muscle cells"FASEB J.. 15. 1472-1474 (2001)
• [Publications] Koh YH, et al.: "Osmotic stress induces HB-EGF gene expression vis Ca2+/JNK signal cascades in rat aortic smooth muscle cells"J Biochem. 130. 351-358 (2001)
• [Publications] Obata H, et al.: "Dye terminator re-cycle-sequencing method : Phage plaque direct sequencing"Analytical Biochem. 272. 102-105 (2001)
• [Publications] Kizaki T, et al.: "Negative Regulation of LPS-Stimulated Expression of inducible Nitric Oxide Synthase by AP-1 in Macrophage Cell Line J774A.1"Biochem Biophys Res Commun.. 289. 1031-1038 (2001)