リステリア感染マクロファージからのTh1細胞誘導因子クローニング(アレルギーを能動的に回避する戦略の開発)

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670219
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 加納 誠 愛媛大学, 医学部, 講師 (10116923)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 角田 恒輔 愛媛大学, 医学部, 助手 (20281454) ; 浅野 喜博 愛媛大学, 医学部, 教授 (70114353)
• Keywords: リステリア感染 / マウスマクロファージ / Th1ダイプサイトカイン応答 / cDNAサブトラクト / cDNA-RDA法 / シグナルシークエンストラップ / Th1誘導因子

Research Abstract

リステリア生菌を感染させたマウス脾臓からのマクロファージの抗原提示ではTh2タイプのサイトカイン応答が抑制され、IFN-γの産生が強められることを見い出した。この現象は抗原非特異的に起こり、リステリア感染を受けた個体の免疫系は無関係の抗原刺激に対してもTh1タイプサイトカイン応答を起こさせることを示している。そこで、リステリア感染マクロファージに強く表現されるmRNAについてcDNA-RDA法、シグナルシークエンストラップ法を用いることによりマクロファージの産生する分泌蛋白に的を絞り込む。
結果
1.リステリア感染マウス脾細胞よりマクロファージを回収し、抽出したmRNAから非感染マクロファージのcDNAでサブトラクトする。cDNAを合成してファージに組み込んでcDNAライブラリーを作製した。
2.マウスにリステリアを感染させ3日後に脾細胞を回収した。非感染細胞からmRNAを回収して2本鎖cDNAを作製してRBAプライマーで増幅しドライバーアンプリコンを得た。一方、感染細胞のmRNAから2本鎖cDNAを作製し、NBAアダプターを結合させてテスターアンプリコンを得た。テスターアンプリコンと過剰量のドライバーアンプリコンを混合し熱変性後、ハイブリダイズさせる。Taq polymeraseを用いて末端を修復した後、NBAプライマーを用いてPCRを行い、テスターからドライバーをサブトラクトした。これをアダプターを換えて数回繰り返した。これをプローブにして先のマクロファージ分泌蛋白ライブラリーをスクリーニングし、リステリア感染によって差のみられる分泌蛋白遺伝子を同定をおこなった。
3.クローニング後、COS細胞にトランスフェクションしTh1細胞を誘導する因子をスクリーニングするためのアッセイ系を現在準備している。