2001 Fiscal Year Annual Research Report
クリプトスポリジウムの遺伝子多型検出法の検討及びその疫学の応用
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13670243
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
呉 志良 岐阜大学, 医学部, 助手 (90313874)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長野 功 岐阜大学, 医学部, 助教授 (40283296)
高橋 優三 岐阜大学, 医学部, 教授 (80094580)
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| Keywords | クリプトスポリジウム / 遺伝子多様性 / PCR / PCR-RFLP / SSCP |
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| Research Abstract |
1.クリプトスポリジウム株の分離:全部でC.parvum50株とC.muris1株が分離された(日本のウシ由来、岐阜10株、大阪2株、神戸12株、名古屋1株;イタリアのウシ由来9株とヤギ由来1株;日本のヒト由来3株、イタリアのヒト由来5株、ネパールのヒト由来9株。C.murisは日本のラット由来である)。
2.RAPDの分離・シークエンス・PCRプライマー作成:DNA多型を検出する方法としてRAPD-PCRを用いて、クリプトスポリジウムの多型遺伝子が増幅された。七つのRAPD断片が分離され、それらの塩基配列をシークエンスした。得られたシークエンスのデータを基にして、七つのプライマーが作成された。PCRでそれらのプライマーの検出特異性を検討して、その結果、SB280、SB281、SB289、SB290、SB294とSB296はC.parvumに特異的(それぞれは853bp、553bp、504bp、304bp、240bpと575bpのPCR産物を増幅した)、SB207はC.murisに特異的なプライマーであることを示した。
3.遺伝子の多様性の解析:RAPD SB281とSB289のDNAシークエンスよりのアミノ酸配列はGenBankにhomologyした結果より、SB281はmethionine aminopeptidaseの遺伝子、SB298はcytosolic chaperoninの遺伝子であることを示した。宿主と地域由来の異なる12株のこの二つ遺伝子をシークエンスした。種間の相同性分析の結果はヒトとウシ由来の塩基配列の違いがあることを示した。さらに、ある地域由来の異なる株に塩基配列の差が存在する事を示した。
以上の結果はRAPDより、作成されたPCRプライマーがクリプトスポリジウムの同定・検出することができる。遺伝子の塩基配列の差を利用するRFLPやRFLP-SSCPの解析によりヒトとウシの遺伝子型、あるいは地域由来の遺伝子型を判別する可能である。
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