トランスシアリダーゼファミリーの構造と機能の多様性と原虫生活環における役割り

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670250
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 上村 春樹 長崎大学, 熱帯医学研究所, 講師 (60184975)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柳 哲雄 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助手 (10174541) ; 神原 廣二 長崎大学, 熱帯医学研究所, 教授 (20029789) ; 藤井 茂 関西医科大学, 医学部, 教授 (60144482) ; 中澤 秀介 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助手 (20180268)
• Keywords: トリパノソーマ / トランスシアリダーゼ / シャガ病 / シアル酸 / 遺伝子ファミリー

Research Abstract

トランスシアリダーゼ(TS)は寄生性のトリパノソーマ原虫に特徴的に検出される酵素で,糖複合体末端のシアル酸を遊離させるシアリダーゼ活性とともに、そのシアル酸を他の糖鎖末端ガラクトース受容体に転移させるトランスファー活性も示す。
シャガス病の病原原虫Trypanosoma cruziでは,trypomastigote型で高い活性が検出され、シアル酸を受け取った原黒表面受容体は、原虫の宿主細胞への侵入過程に重要であることが示されてきている。TSは多くの遺伝子ファミリーからなり、その50%以上は酵素活性を示さない生成物を与えるが、それらの役割は明らかになっていない。またこの酵素は原虫表面で働くとともに血流中にも分泌され、種々の宿主細胞と相互作用していることが予測される。にれらの疑問にアプローチする一つの方法は、精製した活性型、不活性型の酵素を、種々の宿主細胞に働かせて応答を見るこどである。今年度、まずTSの発現と精製方法を確立した。
数年間大腸菌での発現を試みてきたが、発現量が少ない、TSを発現する大腸菌が不安定であるなどの、問題で精製を試みることも出来ていなかった。NaClで発現を誘導する大腸菌E.coli BL21-SI(DE3)株を使用することで発現量と安定性の問題を解決することが出来た。続いて硫安沈殿、DEAE陰イオン交換クロマト、Ni-NTAアフイニテイークロマト、Phenyl ミSepharose疎水クロマトの組み合わせで酵素を精製したす活性を示さない遺伝子産物との立体構造上の違いをNMR、CD, X腺結晶解析の物理化学的手法で検出出来ないかと期待している。また、精製した組換え蛋白質や種々のフラグメントは、宿主細胞・蛋白質との相互作用を調べ、シャガス病の病態に関連する手がかり、ある種の細胞への活性化や抑制が見うれないかと期待して調べている。