2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13670428
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| Research Institution | 宮崎医科大学 |
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Principal Investigator |
高濱 桂一 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (70040160)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳井 章江 山口大学, 医学部, 助手 (20284854)
柿崎 英二 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (70284833)
瀬尾 泰久 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (80187830)
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| Keywords | 溺死 / 水棲細菌 / PCR法 |
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| Research Abstract |
本年度は特に海洋性細菌に着目し、その特異な塩基配列を指標としたPCR法の開発に取り組んだ。指標とする細菌は、世界中に広く棲息し、ヒトへの感染を認めず、日本では特に養殖魚類の病原菌として知られているListonella anguillarum及びPhotobacterium piscicidaの2つについて検討した。L.anguillarum及びP.piscicidaはこれらに感染したニジマス及びブリから単離された菌株を使用し、L.anguillarumについては2日間、P.piscicidaについては3日間平板培地にて培養した。培養後の菌体はSPS存在下でProteinase Kによる消化を行い、フェノール・クロロホルム法及びエタノール沈殿法にて染色体DNAを抽出・精製した。各細菌のプライマーの設計は微生物における系統分類の指標とされている16S rRNAの塩基配列に基づいて、それぞれ2組づつ設計した(L.anguillarum ; La1及びLa2、P.piscicida ; Pp1及びPp2)。また2組のプライマーセットのうち1組(La2及びPp2)は、Nestedプライマーとなるよう設計した。次いで、各細菌から抽出したDNAについてPCR法による標的配列の増幅を試みた。L.anguillarumについては2組のプライマーセットを使用して、La1により882bp、La2により289bpの目的断片の増幅をそれぞれ認めた。一方、P.piscicidaについてはPp1により882bp、Pp2により714bpの目的断片の増幅をそれぞれ認めた。更に、各細菌の検出限界についてはNested PCR法を利用してL.cnguillarumが100fg、P.piscicidaが1pgまで検出可能であった。また、健常者の血液から抽出したヒトDNAとの交叉性は、認められなかった。
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