C型肝炎ウイルスの増殖に必要な肝細胞内の因子の特定と増殖阻害剤の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670521
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 茶山 一彰 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00211376)
• Keywords: HCV / RT-PCR / クローニング / HCV infectiousclone / IFN-β

Research Abstract

平成14年度には、C型急性肝炎患者血清を用いて、HCVの全領域の遺伝子をRT-PCRにより増幅し、direct sequence法で全塩基配列の決定を行い、クローニング、変異導入を行った。H15年度には、それぞれのクローンを連結してdirect sequenceと一致するHCVクローンを作製し、PBR322にHCV全長、T7プロモーター、HDVリボザイムが挿入されたコンストラクト(HCV infectious clone)を得た。さらに、T7RNA polymerase発現ベクターをキュアード細胞にstable transufectionし、HCV infectious cloneをstable transfectionしてHCV持続発現細胞株の作製を試みた。HCV core蛋白を定量的に測定したところ、細胞内では多量にHCV core蛋白が発現されていたが、細胞上清への放出は微量であった。また、HCV infectious cloneをRNAに転写し、その転写産物を、ヒト肝細胞キメラマウスを使用し、in vivoで投与を行いHCV複製について血清のRT-PCR、肝組織の免疫染色などにより感染性の検討を行った。これまでに、明らかな感染は認められていないが、ヒト患者血清から得られたHCVの投与実験ではキャリア状態を作製することが出来た。
また、平成14年度には、E2、NS5A蛋白を恒常的に発現する細胞株を作るために、IFN抵抗性のC型肝炎患者のE2、NS5Aをインフルエンザウイルスベクターに組み込んで、293T細胞、MDCK細胞に感染させて蛋白発現を試みたがE2およびNS5A共に蛋白発現が低かった。そこで、平成15年度には、上記のHCV infectious cloneの各領域(core、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS5A、NS5B)を真核細胞発現ベクター(pKS336)に組み込んだ。それらをHuh7細胞にtransfectionし、各領域の蛋白発現細胞を作製し、蛍光抗体およぴ免疫沈降により各領域の蛋白発現を確認した。E2領域を除いては各蛋白の発現を確認することが出来た。さらに、各領域がpKS336に組み込まれたプラスミドとIFN-βpromoter-Luciferaseプラスミドをco-transfectionし、PolyI : Cで刺激し、IFN-βの産生に対する影響について検討を行った。これまでに、数領域でIFN-βの作用を阻害している結果が得られた。

Research Products

• [Publications] Kazuaki Chayama: "Management of chronic hepatitis C and prevention of hepatocellular carcinoma"Journal of Gastroenterology. 37・13. 69-73 (2002)
• [Publications] K.Chayama, N.Manabe, K.Harumaほか5名: "Evaluation of quantitative measurements of hepatitis C virus RNA to predict sustained response to interferon by genotype"Journal of Virological Methods. 95・6. 33-45 (2001)
• [Publications] 大石和佳: "HCV-RNA定性的測定法(1)RT-PCR法(2)その他のHCV-RNA検出法"日本臨床増刊. (2004)
• [Publications] 茶山一彰: "インターフェロンによるウイルス排除のメカニズム"肝胆膵. 45. 989-993 (2002)
• [Publications] K.Kamada, M.Kitamoto, Chayama K.ほか5名: "Combination of transcatheter arterial chemoembolization using cisplatin-lipiodol suspension and percutaneous ethanol injection for treatment of advanced small hepatocellular carcinoma"Am J Surg. 184,3. 284-290 (2002)
• [Publications] M.Sakomoto, S.Tazuma, Chayama K.: "Less hydrophobic phosphatidylcholine species simplify biliary vesicle morphology, but induce bile metastability with a broad spectrum of crystal forms"Biochem J. 362,Pt1. 105-112 (2002)
• [Publications] S.Tazuma, T.Nishioka, Chayama K.ほか13名: "Impaired gallbladder mucosal function in aged gallstone patients suppresses gallstone recurrence after successful extracorporeal shock wave lithotripsy"J Gastroenterol Hepatol. 18,2. 157-161 (2003)
• [Publications] J.Tanaka, H.Kumada, K.Ikeda, Chyama K.ほか7名: "Natural histories of hepatitis C virus infection in men and women simulated by the markov model"Journal of medical virology. 70,3. 378-386 (2003)
• [Publications] W.Ohishi, M.Kitamoto, Chayama K.ほか7名: "Impact of aging on the development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus infection in Japan"Scand J Gastroenterol. 38,8. 894-900 (2003)
• [Publications] K.Nakai, S.Tazuma, T.Nishioka, Chayama K.: "Inhibiton of cholesterol crystallization under bilirubin deconjugation : partial characterization of mechanisms whereby infected bile accelerates pigment stone formation"Biochim Biophys Acta. 1632,1-3. 48-54 (2003)
• [Publications] T.Kamada, K.Haruma, Chayama K.ほか7名: "Significance of an exaggerated meal-stimulated gastrin response in pathogenesis of Helicobacter pylori-negative duodenal ulcer"Dig.Dis.Sci.. 48,4. 644-651 (2003)
• [Publications] K.Tsuboi, S.Tazuma, H.Ochi, Chayama K.: "Hydrophilic bile salts have a cytoprotective effect against cyclosporine A-induced cholestasis through enhanced canalicular membrane fluidity and transporter activity"Hepatology Research. 25,1. 38-47 (2003)
• [Publications] W.Ohishi, Chayama K.: "Rare Quasispecies in the YMDD Motif of Hepatitis B Virus Detected by Polymerase Chain Reaction with Peptide Nucleic Acid Clamping"Intervirology. 46,6. 355-361 (2003)
• [Publications] 茶山一彰: "B型・C型肝炎の病態と治療"犬山シンポジウム記録刊行会. 6 (2003)