初期炎症機転抑制による血管リモデリング進展予防の試み -変異型インターフェロンγ受容体遺伝子導入による遺伝子治療-

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13670769
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 関 幸彦 久留米大学, 医学部, 助手 (00279168)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 新山 寛 久留米大学, 医学部, 助手 (30309778) ; 桑原 史隆 久留米大学, 医学部, 助手 (90279167) ; 甲斐 久史 久留米大学, 循環器病研究所, 助教授 (60281531) ; 明石 英俊 久留米大学, 医学部, 講師 (80184084)
• Keywords: 遺伝子治療 / 動脈硬化 / インターフェロンγ

Research Abstract

(1)INF-γR/Fcキメラ遣伝子作成と、そのドミナントネガティブ活性検討:INF-γR細胞外ドメインに免疫グロブリンFc鎖を結合させたHA-taggedキメラ遺伝子をPCR法を用いて作成し発現プラスミドベクターpVR1255に組み換えた(pV1255INF-γR/Fc)。in vitro発現系を用いてINF-γR/Fcタンパク質を精製した。INF-γ投与によるヒトマクロファージー酸化窒素産生活性化をマーカーとしたin vitroアッセイ系によりINF-γR/Fcタンパク質の抑制作用を確認した。
(2)INF-γR/Fc遺伝子導入法の確立:HA-tagged INF-γR/Fc遺伝子組み換え発現プラスミドpV1255INF-γR/Fcをnaked DNA法にてマウスあるいはラット大腿骨格筋に筋注導入し局所でINF-γR/Fcタンパク質を発現させ、血中に分泌されたINF-γR/Fcにより生体内の作用部位(傷害血管)においてINF-γ機能を拮抗阻害するという戦術を用いる。この方法には、免疫原性の低いnaked DNA法により標的遺伝子を骨格筋局所に導入することから、遺伝子を繰り返し導入し長期間にわたり発現を維持する事が可能であると考えられることから慢性疾患モデルに応用できるメリットがある。
局所発現を抗HA免疫染色にて、血中INF-γR/Fc濃度を抗INF-γR ELISA法にて、INF-γR/Fc発現の程度と時間経過を検討したところ、導入局所骨格筋および血中のINF-γR/Fc発現は、導入後1日以降第2-3日をピ-クとし漸減したが、少なくとも第14日までは有意な発現を認めた。また、繰り返し投与(2週間ごと)により有効な血中濃度を維持しうるかも確認した。
(3)動脈硬化モデル:ApoEノックアウトモデル(ApoE-KO群)と野生型マウス(対照群)を用いて、以下の予備実験及び検討を行った。
ApoE-KO群の病変部位において、RT-PCR法によりINF-γ発現を、免疫組織染色法によりT細胞・単球などの炎症細胞浸潤を、オイルレッド染色により脂質沈着を、マッソントリクロム染色により組織線維化を、BrdU発現ラベル法により平滑筋細胞増殖を、TUNEL法により平滑筋細胞アポトーシスを、免疫組織染色法により平滑筋細胞形質転換を確認した。
動脈硬化病変が完成するApoE-KO群12週令からINF-γR/Fc遺伝子導入を(2週間毎)行い(ApoE-KO/治療群)、16,20,24週令に動脈硬化病変(動脈硬化面積、内膜肥厚、脂質沈着、T細胞・単球などの炎症細胞浸潤、平滑筋細胞増殖・アポトーシス・形質転換、組織線維化、プラーク安定化スコア)を評価し、動脈硬化の発症を予防しうるか、進行を遅らせることができるか否かを現在検討中である。遺伝子治療群において、動脈硬化面積・内膜肥厚が抑制され、プラーク安定化スコア高値である結果が得られており、鋭意解析中である。