2001 Fiscal Year Annual Research Report
辺縁帯形成におけるcystatin A架橋メカニズムとその役割
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13670860
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
高橋 英俊 旭川医科大学, 医学部, 講師 (00216748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 康裕 旭川医科大学, 医学部, 助手 (90332486)
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| Keywords | cystatin A / 辺縁帯 / 架橋 / 遺伝子調節 / MAPK / ERK / JNK / 皮膚 |
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| Research Abstract |
1)現在我々が保有しているhuman cystatin A cDNAをGST遺伝子の下流につないだ大腸菌発現ベクターを作製し、合成蛋白を作製した。western blot法によりcystatin Aが発現されていることを確認後、GSTカラムおよびトロンビンにて合成cystatin Aを生成した。
次に、合成cystatin A蛋白をトタンスグルタミネース(宝酒造より購入)によりin vitroで反応、反応産物をSDSページにより検討したところ2から4merのcystatin A産物の形成を認め、cystatin Aがトタンスグルタミネースにより架橋させる確認された。現在、3H-プトレシンと生成cystatin Aを架橋させ、この架橋物をトリプシン処理しHPLCにて分画、架橋部位を同定中である。
2)cystatin Aの遺伝子調節機構を検討するため、cystatin A遺伝子プロモーター領域をCAT遺伝子につないだレポーターベクターと各種MAPK発現ベクターを正常角化細胞に導入し、プロモーター活性を検討した。dominant negative ERK、MEK1、raf-1を導入するとその活性は上昇した。一方、dominant negative JNKを導入すると逆に抑制された。この現象はアデノウイルスベクターを用いて、蛋白レベルでの検討において確認された。免疫組織学的にERKおよびJNKの局在、活性について検討したところ、活性化ERKは基底細胞に、活性化JNKは有棘層上層から顆粒層にかけて認められた。以上の結果からcystatin AはERK、JNKにより発現はそれぞれ抑制、増強され皮膚においての発現はERKおよびJNKの局在の違いにより調節されていると推定した。
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[Publications] H.Takahashi et al.: "Expression of human cystatin A by keratinocytes is positively regulated via Ras/ERK/MEKK1/MKK7/JNKsinnal transduction pathway but negatively"J. Biol Chem. 276. 36632-36638 (2001)
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[Publications] H.Takahashi et al.: "Transcriptional factor AP-2 gammma increases human cystatin A"Biochem Biophys Res Commun. 278. 719-723 (2000)
