SIVウイルスベクターを用いた血友病Aに対する遺伝子治療法の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671078
• Research Institution: Jichi Medical School
• Principal Investigator: 窓岩 清治 自治医科大学, 医学部, 講師 (70296119)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂田 洋一 自治医科大学, 医学部, 教授 (40129028) ; 水上 浩明 自治医科大学, 医学部, 助手 (20311938)
• Keywords: 血友病 / 血液凝固第VIII因子 / 遺伝子治療 / SIVウイルスベクター / 造血幹細胞 / 脂肪細胞 / NOD / SCIDマウス / db / dbマウス

Research Abstract

Simian Immunodeficiency Virus(SIV)ベクターを用いた血友病Aに対する遣伝子治療法の開発を目的とし、SIVウイルスベクターにヒト血液凝固第VIII因子(hFVIII)を発現させるコンストラクトを構築し、標的細胞への導入効率、発現効率を検討するともに、小動物(マウス)生体内でのhFVIIIの活性および抗原の発現について解析した。(1)遺伝子導入CD34陽性細胞のNOD/SCIDマウス移植モデルを用いた検討:CMVプロモーターの下流にgreen fluorescent protein(GFP)またはhFVIII遺伝子を搭載したSIVベクターを、ex vivoでヒト臍帯血由来CD34陽性細胞に感染させた。transductionを検討し、MOI 5X10(3)vg/cellで最大99.6%の細胞がGFP陽性となった。hFVIII搭載SIVベクターを感染させたCD34陽性細胞は、10(6)個・24時間あたり274.3±20.1ngのhFVIIIを産生していることから、in vivoへの応用に対し充分な量であると考えられた。亜致死量の放射線照射を加えたNOD/SCIDマウスに対して、遺伝子導入した5-10 X 10(5)個のCD34陽性細胞の移植を行い、レシピエントマウス骨髄組織への生着率と末梢血中のhFVIII抗原量を測定した。移植10週間後のマウス血漿中にはhFVIIIが1.2-3.6ng/mLの濃度で検出され、移植12週間後の骨髄中にはヒトCD45,CD34陽性細胞が全骨髄細胞中3-10%を占めており、その生着を確認できた。(2)脂肪細胞およびdb/dbマウスの皮下脂肪組織への遣伝子導入:hFVIII遺伝子から活性発現に影響のないB領域を除去したBDD-FVIII遺伝子を搭載したSIVウイルスベクターを構築した。BDD-hFVIII搭載SIVウイルスベクターを培養脂肪細胞NIH3T3-L1に感染させると、10(6)個・24時間あたり320±39.8ngのhFVIIIの産生が得られた。BDD-hFVIII搭載SIVウイルスベクターをdb/dbマウスに背部皮下脂肪組織に遣伝子導入したところ、第11日目のマウス血漿中に1.8ng/mLのhFVIIIが検出された。遣伝子導入したマウス皮下組織を用いたRT-PCR法により、hFVIIImRNAが検出されるとともに、免疫組織学的にhFVIII抗原を確認できた。これらの結果は、hFVIII遣伝子搭載SIVベクターを用いた血友病Aに対する遣伝子治療への基盤研究と成り得るものと考えられる。

Research Products

• [Publications] Madoiwa S: "Successful Induction of Immune Tolerance by Neonatal Injection of Human Factor VII in Murine Hemophilia A"J Thromb Haemostat. (in press).
• [Publications] Ogata K: "Expression of human coagulation factor VIII in adipocyte transduced with the simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vector for hemophilia A gene therapy"Gene Therapy. (in press).
• [Publications] Mimuro J: "A primate model for hemophilia B gene therapy research"British Journal of Haematology. (in press).
• [Publications] Kikuchi J: "Sustained transgene expression by human cord blood-derived CD34+ cells transduced with simian immunodeficiency virus agmTYO1-based vectors carrying the human coagulation VIII gene in NOD/SCID mice"British Journal of Haematology. (in press).
• [Publications] Naito M: "Defective Sorting to Secretory vesicles in the trans Golgi network is partly responsible for protein C deficiency : Molecular mechanisms of impaired secretion of abnormal protein C R169W, R352W and G376D"Circulation Res.. (in press).
• [Publications] Sigeta K: "In vitro platelet activation by an echo-contrast agent"J Ultrasound in Medicine. (in press).
• [Publications] Imura O: "Effect of ureteral obstruction on gelatinase A in rat renal cortex"Exp. Nephron. (in press).
• [Publications] Miyoshi T: "Acute promyelocytic leukemia accompanied by retinoic acid syndrome complications of acute myocardial infarction and cerebral infarction during treatment with all-trans retinoic acid"Rinsho Ketsueki. 954-959 (2002)
• [Publications] Kaminishi Y: "Modified Bentall Operation in a Patient With Hemophilia A"The Japanese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 51(2). 68-70 (2003)