単鎖抗体ScFvを結合させたユビキチンリガーゼによる変異型p53の選択的な分解

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671261
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 福田 護 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (50081724)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 太田 智彦 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (60233136)
• Keywords: 遺伝子治療 / タンパク質分解 / scFv / ユビキチンリガーゼ / p53 / RINGフィンガー

Research Abstract

Pab240はp53遺伝子の癌で認められるメジャーなDominant Negative変異であるR273P,R175H,あるいはV143Aにともなって起きるタンパク質の構造変化によって露出するepitopeを特異的に認識する抗体である。Pab240を産生するハイブリドーマ細胞より、H鎖とL鎖のepitope認識部位(可変領域)をそれぞれクローニングしLinkerにて結合し、単鎖抗体(SgFv)を作成し、sequenceを確認した。これと平行してBRCA1とBARD1のRINGフィンガーを組み込んだ人工的なユビキチンリガーゼを作成した。最近われわれは家族性乳癌の原因遺伝子であるBRCA1とBARD1のRINGフィンガーがheterodimerとして高いユビキチンリガーゼ活性を持つことを発見した(J. Biol. Chem. 276:14537-,2001)。これら2つのRINGを1つの遺伝子に組み込んだところ(RING-RING)、その遺伝子産物はhomo-trimerを形成し、非常に高いユビキチンリガーゼ活性を有していた。この2つのRINGドメインに、さらにp57にたいする基質結合ドメインとしてPCNAを結合させた(RING-RING-PCNA)ところ、in vivoにてp57をdosage dependentに分解した。MG132とLLnLでこの分解が阻止できることから、プロテアソーム依存性分解であることが証明された。他のコントロールのタンパク質に対してはこの様な作用はなく、分解は特異的であった。さらに、RING-RING-PCNAはp57によって抑制された細胞増殖を回復せしめた(Biochem. Biophys. Res. Commun. 295:370-,2002)。以上より、RINGフィンガーをもちいて人為的に標的としたタンパク質の分解が可能なことが判明した。このRING-RINGユビキチンリガーゼの基質結合部分にPCNAのかわりに上記のScFvを結合させたタンパク質を作製したが現在のところ変異型p53のユビキチン化には成功していない。その原因として作製したScFvと変異型p53とのAffinityが弱いことが考えられたため、新たなScFvをDNA合成法によって作製した。

Research Products

• [Publications] Rintaro Hashizume: "The RING heterodimer BRCA1-BARD1 is a ubiquitin ligase inactivated by a breast cancer-derived mutation"Journal of Biological Chemistry. 276(18). 14537-14540 (2001)
• [Publications] Ichiro Maeda: "In vitro Ubiquitination of Cyclin D1 by ROC1-CUL1 and ROCI-CUL3"FEBS letters. 494(3). 181-185 (2001)
• [Publications] 太田智彦: "BRCA1のもう一つの機能 -ユビキチンリガーゼ活性-"細胞工学. 20(6). 854-856 (2001)
• [Publications] Daisuke Oyake: "Targeted substrate degradation by an engineered double RING ubiquitin ligase"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 295(2). 370-375 (2002)
• [Publications] 太田智彦: "BRCA1遺伝子と予防的両側乳房切除術"乳癌の臨床. 17(3). 210-216 (2002)
• [Publications] Peter S.Brzovic: "Binding and Recognition in the Assembly of an Active BRCA1-BARD1 Ubiquitin Ligase Complex"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (In Press). (2003)