GFPによるアドレナリン受容体のリアルタイムでの可視化

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671605
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (50239266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西 真弓 京都府立医科大学, 医学部, 講師 (40295639)
• Keywords: GFP / アドレナリン受容体

Research Abstract

平成13年度は計画通りアドレナリン受容体とGFPとの融合遺伝子の作成を行った。
ヒトβ2及びα2A,α2B,α2Cアドレナリン受容体の4種のcDNAについて、QuikChange或いはGene Editor kitを用いて各受容体のstop codonをKpn I Siteに変えるpoint mutationを行い、このconstructをEcoR I-Kpn I digestionにより切り出し、pEGFPN-1 vectorに移し替え、カルボキシル基末端にGFPをつけたアドレナリン受容体を得た。同様に、pGEMT-easy vector上のconstructをEcoR I digestionにて切り出し、pCDNA3.1 vectorに移し替え、これをwild type controlとした。
pEGFPとpCDNA vectorに移したconstructをDEAE dextran法によりCOS cellにtransient transfectionし、得られた細胞膜分画を用いてRI assayを行い、GFP癒合受容体がwild typeと同様にfunctionalであることを確認した。
α2A,α2B,α2Cアドレナリン受容体はGC含量が非常に高いことからpoint mutationに多くのassayを必要としたため、初年度では機能確認までしかできなかった。ヒトβ2アドレナリン受容体GFP癒合蛋白では、レーザー共焦点顕微鏡を用いてagonist投与時の受容体の細胞膜での動態観察を行い、この結果を平成14年4月のヨーロッパ麻酔学会で発表する。