接着性細胞の膜面と関連細胞骨格に関する超音波細胞剥離による超微構造解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671925
• Research Institution: Asahi University
• Principal Investigator: 明坂 年隆 朝日大学, 歯学部, 教授 (70116523)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 寿穂 朝日大学, 歯学部, 助手 (80102119)
• Keywords: 培養破骨細胞 / 超微構造 / 超音波細胞剥離 / ポドゾーム / クラスリンシート / 細胞骨格 / 三次元可視化

Research Abstract

接着性細胞としてウサギ長管骨骨髄から破骨細胞を分離培養したものを用いた。破骨細胞をガラス面上で培養すると加伽と同様な典型的な接着構造としてのポドゾームが出現する。ポドゾームはアクチンが主体となった細胞骨格構造が三次元的に配列するフォーカルコンタクの一種であり動的に変化する構造である。そのような破骨細胞に超音波処理して非接着側細胞膜を剥離して細胞質構造を適度に除去すると接着側細胞膜と接着構造としてのポドゾームが残存した。目的とする構造を残すための最適条件は超音波の出力と作動時間、チップ先端と試料との距離に依存し検討の結果30W,1〜5秒、2〜3cmであった。そのような条件下で処理し細胞骨格関連蛋白抗体を用いレーザー顕微鏡で蛍光免疫染色した試料からは未処理の場合と同一の局在パターンを示すことが判明し超音波剥離は蛋白局在について峠影響が無いことが明らかとなった。超微構造レペル観察では接着側細胞膜内面が露出し膜面上の粒子構造とアクチン細胞骨格力漣結していた。ポドゾーム構造は他の細胞骨格構造に比べ明らかに強固に膜面と連結していた。ポドゾーム周辺には大小不定形のクラスリンシートが出現しポドゾームと共存していた。
次年度はコロイド化学を用いて超微構造レベルでの細胞骨格関連蛋白局在を明らかにすると共にミオシンサブフラグメントをアクチンに修飾させてアクチン線維の極性を決定し得られた所見からパーソナルコンピューターで三次元可視化してポドゾームの機能と構造を解析する予定である。