アデノウイルスベクター発現系による唾液腺SNARE蛋白質の機能解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13671946
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254)
• Keywords: アデノウイルス / SNARE / 唾液腺 / 開口分泌 / GFP

Research Abstract

これまでの研究で、我々はAdeno-X expression Systemを用い、VAMP-2-FLAGとGFPが同時に発現するアデノウイルス・ベクターを構築した。このウイルスをprimaryのラット耳下腺細胞、およびラット顎下腺にin vivoで導入し、生きた細胞でGFPの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡下で観察するとともに抗FLAG抗体による免疫組織化学でVAMP-2-FLAGの発現を観察した。他方、ヒト耳下腺由来細胞HSYを用いSyntaxin-4の細胞内輸送におけるMunc18cの役割を調べた。これまでに得られた研究成果を以下に示す。
(1)コラゲナーゼ消化法で調製したprimaryの耳下腺細胞に上記アデノウイルス・ベクターを用いVAMP-2-FLAGとGFPを発現させたところ、VAMP-2-FLAGは細胞内の膜系に存在した。
(2)上記アデノウイルスをラット顎下腺に直接注入し48時間後に唾液腺を固定し免疫組織化学的に観察したところ、VAMP-2-FLAGは主として顎下腺線条部導管に発現し、細胞の基底側小胞体に強い反応が認められた。
(3)HSY細胞にGFP-Syntaxin-4を発現したところ未同定の膜構造を形成し、細胞膜への輸送・発現は見られなかった。しかし、Syntaxin-4結合タンパク質であるMunc18cを共発現したところSyntaxin-4とVAMP-2やSNAP-23との結合は抑制され、細胞膜での発現が認められた。この結果、Munc18cはSyntaxin-4とVAMP-2やSNAP-23を含む他のタンパク質との相互作用を抑制し、Syntaxin-4を細胞膜まで確実に輸送する役割を担っていることが示唆された。

Research Products

• [Publications] Takuma, T., Arakawa, T.他4名: "Trafficking of Green Fluorescent Protein-Tagged SNARE Proteins in HSY Cells"J. Biochemistry. 132・(5). 729-735 (2002)