難治性根尖性歯周炎にむける血管内皮細胞が好中球の一酸化窒素産生に及ぼす影響

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672013
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 武市 収 日本大学, 歯学部, 助手 (10277460)
• Keywords: 難治性根尖性歯周炎 / 血管内皮細胞 / 好中球 / 一酸化窒素 / LPS / IL-1β / インターフェロンγ

Research Abstract

1.臍帯静脈血由来血管内皮細胞(HUVEC)の分離:臍帯静脈を通法に従い、コラゲナーゼ処理し、細胞浮遊液からHUVECを分離した。
2.HUVECとPB-PMNsの共培養:HUVECを血管内皮細胞専用液体培地中で、37℃、CO_2インキュベーターにて細胞培養した。2代継代培養を行ったのち、コンフルエントになったHUVEC上にPB-PMNsを播種し、共培養を行った。その際、Porphyromonas gingivalis由来LPS、IL-1およびインターフェロンγで刺激した。培養終了後、培養液を回収したのちHUVECをFBS添加EDTA液でカルチャープレートから浮遊させ、浮遊細胞の回収を行った。
3.NO濃度の測定:通法に従い、培養液中のNitrite濃度を測定した。すなわち、培養液と同量のGriess試薬を加え、10分間反応させたのち、波長540nmにて吸光度を測定した。その際、亜硝酸ナトリウムを希釈したものを用いて同様に反応させ、検量線を作成することで、NO濃度の算定を行った。その結果、NO濃度は32.2±7.2μMであった。
4.免疫組織学的検索:通法に従い、抗ヒトiNOS抗血清を用いたABC法を行い、HUVECのiNOS産生を免疫組織学的に検索した。すなわち、HUVECに抗ヒトiNOS抗血清を反応させたのち、アルカリフォスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体を反応させ、発色させたのち光学顕微鏡で鏡検した。その結果、血管内皮細胞のiNOS産生を確認した。