根尖性歯周炎関連細菌によるMMPの活性化とTIMPの不活性化についての研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672015
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 中村 洋 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40064878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 是孝 愛知学院大学, 歯学部, 助手 (00329608)
• Keywords: ヒト歯根膜細胞 / P.gingivalis / 超音波破砕菌体抽出物(SBE) / MMP-2 / TIMP

Research Abstract

1)ヒト歯根膜(PL)細胞の調製 新鮮抜去歯を小組織切片に細切して,セルカルチャーディッシュ(CORNING)中に静置し,10%ウシ胎児血清(FBS;免疫生物研究所)含有RPM11640培地(日水製薬)を加え,37℃,5%CO2下で培養する。そして,組織片より遊出した細胞がコンフルエントな状態になった後,継代培養を行い,実験には4〜8継代したものを使用するため、その培養系統を確立した。
2)使用細菌および超音波破砕菌体抽出物(Sonicated Bacterial Extract; SBE)の調製 4種の偏性嫌気性グラム陰性菌(P.endodontalis ATCC35406,P.gingivalis381,F.nucleatum ATCC10953,P.intermedia ATCC25611)の4種を通法に従って,37℃,70〜120時間嫌気培養し、全菌体を集菌する。集菌した菌体を、Sonifer250を用いて超音波破砕処理を行い、遠心分離をして未破壊の菌体を除去し、上清画分を採取する。その画分を濾過フィルター(CORNING, CANADA)にて濾過滅菌後,Protein assay kit(Bio-Rad,東京)を用いてタンパク量を測定する。タンパク濃度をそれぞれ1mg/mlになるように調製したものを超音波破砕菌体抽出物(Sonicated Bacterial Extract;SBE)として以後の実験に使用する。
3)ヒト線維肉腫(HT1080)細胞培養上清の調製 HT1080細胞を,10%ウシ胎児血清(FBS;免疫生物研究所)含有RPMI1640培地を用いて、37℃,5%CO2下で培養する。コンフルエント後,無血清RPMI1640培地におきかえて48時間培養する。その上清を回収し,遠心分離後、その上清を試料とする。
4)TIMP-1およびプロMMP-2の調製 TIMP-1は,ヒト歯肉細胞培養液からKodamaら(Monoclonal antibodies to bovine collagenase inhibitor. Collagen.Rel.Res.,7:34l〜350,1981.)の方法に準じて精製する。また,プロMMP-2は,ヒト歯肉細胞培養液からSakamotoら(Degradation of T-kininogen by cathepsin D and matrix metalloproteinases.Immunopharmacology,32:73-75,1996.)の方法に準じて精製した。