根尖性歯周炎関連細菌によるMMPの活性化とTIMPの不活性化についての研究

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672015
• Research Institution: Aichi Gakuin University School of Dentistry
• Principal Investigator: 中村 洋 愛知学院大学, 歯学部, 教授 (40064878)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 是孝 愛知学院大学, 歯学部, 助手 (00329608)
• Keywords: ヒト歯根膜細胞 / 超音波破砕菌体抽出物(SBE) / P.gingivalis / MMP-2 / TIMP

Research Abstract

プロMMP-2は、ヒト歯肉細胞培養液からSakamotoらの方法に準じて作製する。これとP.gingivalis SBEを37℃でオーバーナイト反応させた物を試料として、MMP-2とSBEの反応の検索を細胞培養液上清を用いた時と同様に、ゼラチンザイモグラム法にて解析する。
上記の試料を反応させたのち、ゼラチン-セルロファインアフィニティーカラム(φ1cm、1ml gel)を用いて、反応液中のP.gingivalisプロテアーゼとMMPを分離する。カラムの洗浄は1.0M NaCl、10mM CaCl_2を含む30mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)(緩衝液A)で行う。溶出は、10%DMSOを含む緩衝液Aを使用する。各カラム画分中のプロテアーゼ活性をゼラチンザイモグラム法にて確認し、最も活性の高い画分とゼラチンを37℃でオーバーナイト反応させて、SDS-PAGEによりゼラチン分解活性を解析する予定である。
これにより、溶出画分がゼラチンを分解し、さらにMMPインヒビターであるEDTAを作用させることで、その活性が阻害されることが確認できれば、P.gingivalis SBEよってプロMMP-2が活性化され、ゼラチンを分解することが確認できることとなる。
上記計画で実験を進めたが、ゼラチン-セルロファインアフィニティーカラムによるプロテアーゼの分離が思うようにできていないのが現状である。カラムに詰めるセルロファインの調製に問題があるか、洗浄・溶出の段階でのテクニックエラーの可能性が考えられるため、今後も詳細を修正し、検討していく予定である。