分子生物学的手法による口腔内微生物群集の構造解析ならびにそのシステム化

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672202
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 坂本 光央 理化学研究所, 微生物分類室, 協力研究員 (50321766)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 梅田 誠 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (90193937) ; 辨野 義己 理化学研究所, 微生物分類室, 室長(研究職) (40087599)
• Keywords: 歯周病 / 侵襲性歯周炎 / 慢性歯周炎 / スピロヘータ / 口腔内細菌 / 16S rRNA遺伝子 / T-RFLP

Research Abstract

【目的】我々は既に16S rDNAクローンライブラリー法を用いて口腔内細菌の多様性を解析し,報告した。本年度は,口腔内細菌と歯周疾患に関する研究の新たな試みとして、Terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP)法を用いて,口腔内細菌の多様性解析におけるその有効性を検討したので報告する。
【方法】健常人および歯周病患者,各18名の唾液サンプルから染色体DNAを抽出し,16S rRNA遺伝子を標的として,ユニバーサルプライマーおよびスピロヘータ特異的プライマー(forwardプライマーの5'末端を6-FAMで蛍光ラベル)を用いてPCR法により目的の領域を増幅した。得られた増幅断片をHha IあるいはMsp Iを用いて制限酵素処理し,ABI PRISM310 Genetic Analyzerを用いて,それらのフラグメントパターンを解析した。
【結果および考察】ユニバーサルプライマーを用いた場合,健常人および歯周病患者由来のT-RFLPパターンは,いくつかの異なったクラスターを形成したが,同グループを明確に区別するものではなかった。歯周病患者のグループにおいては病態(侵襲性および慢性歯周炎)ごとにクラスターを形成する傾向が認められた。一方,スピロヘータ特異的プライマーを解析に用いた場合,両グループをより明確に区別することができた。以上の結果より,口腔内細菌の多様性の解析方法の一つとしてT-RFLP法を適用することは有効であり,迅速に健常人および歯周病患者の口腔内細菌叢を比較できるものと考えられる。