新規な分子認識モデュールとしての抗体模倣ペプチド修飾シクロデキストリンの創製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672249
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
• Keywords: 分子認識モデュール / シクロデキストリン / 抗体 / 相補性決定部 / 抗体模倣ペプチド / CD-CDR

Research Abstract

抗体は診断試薬として不可欠であるばかりか治療薬への応用も期待されている。しかし、天然型の抗体は高分子量のタンパク質であるため、組織細部への浸透性に乏しいうえクリアランスが小さい。また、構造決定も困難で、分子認識機構の研究には不向きである。そこで、シクロデキストリン(CD)の水酸基を抗体の相補性決定部(CDR)に相当する低分子量の合成ペプチドで修飾した新規な分子認識モデュール(CD-CDR)の創製を企てた。前年度にモデルゲスト分子として11-デオキシコルチゾール(11-DC)を取り上げ、β-CDの1級水酸基を抗11-DCモノクローナル抗体H鎖のCDR3(親和力・特異性の発現に最も重要なCDR)で置換したCD-CDRを試作した。このものは11-DCに対してβ-CDそれ自体に比べ5倍程度大きな親和力を獲得したものと推測された。そこで、11-DC以外の各種ステロイドを認識するCD-CDRを作製するために、必要となる抗体CDR配列の解析を行った。臨床診断上重要なステロイド[コルチゾール、エストラジオール、ジゴキシン、デオキシコール酸、リトコール酸サルフェート、ウルソデオキシコール酸3-サルフェート]を選択し、これらハプテンに対するマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマからRNAを抽出して、RT-PCRによりH鎖及びL鎖の可変部ドメイン(V_H、V_L)の遺伝子をクローニングした。その塩基配列を解析してアミノ酸配列を決定し、各抗体のCDR配列を特定したところ、CDR3を構成するアミノ酸残基はV_Hでは9-15と変動し、V_Lは9と一定であった。また、可変部サブグループは、V_HはコルチコイドとジゴキシンではIIA又はIIB、その他は全てIIIDで、V_Lは二例を除きIIもしくはVであった。これらの知見を基盤としてランダムなアミノ酸配列のCDR模倣ペプチドを修飾したCD-CDRライブラリーを構築し、実用的な結合特性を獲得した分子種を探索することが可能と期待される.

Research Products

• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Single-chain Fv fragments derived from an anti-11-deoxycortisol antibody. Affinity, specificity, and idiotype analysis"Steroids. 67・8. 733-742 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "A monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay of glycolithocholic acid sulfate in human urine for liver function test"Steroids. 67・10. 827-833 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Generation of a novel monoclonal antibody against cortisol-[C-4]-bovine serum albumin conjugate : application to enzyme-linked immunosorbent assay for urinary an serum cortisol"Analytical Sciences. 18・12. 1309-1314 (2002)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Idiotype-anti-idiotype-based noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay of ursodeoxycholic acid 7-N-acetylglucosaminides in human urine with subfemtomole range sensitivity"Journal of Immunological Methods. 272・1-2. 1-10 (2003)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Monoclonal anti-idiotype antibodies recognizing the variable region of a high-affinity antibody against 11-deoxycortisol. Production, characterization and application to a sensitive noncompetitive immunoassay"Journal of Immunological Methods. 274・1-2. 63-75 (2003)