胃プロトンポンプの細胞内局在化と機能制御に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13672276
• Research Institution: TOYAMA MEDICAL AND PHARMACEUTICAL UNIVERSITY
• Principal Investigator: 浅野 真司 富山医科薬科大学, 生命科学実験センター, 助教授 (90167891)
• Keywords: プロトンポンプ / 構造機能相関 / 部位特異的変異導入 / 能動輸送 / 胃酸分泌 / 阻害剤 / プロテアソーム / ユビキチン

Research Abstract

胃酸分泌を行うプロトンポンプは触媒鎖であるα鎖と,非触媒鎖である糖蛋白質β鎖からなる.私はHEK-293細胞を用いてプロトンポンプのα鎖/β鎖の安定発現株細胞を構築した.安定発現細胞はカリウムイオンの代替イオンであるRb^+や,プロトンの輸送活性を示し,ポンプ阻害剤によって阻害された.このように我々はプロトンポンプのイオン輸送能を保持した安定発現細胞の構築に成功した(Kimura et al., J. Biochem.)
ポンプのβ鎖に特徴的に存在する三つのジスルフィド結合の機能的な役割を明らかにする為に,β鎖に存在する9つのシステイン残基(6つはジスルフィド結合を形成し,他の3つはシステインとして存在する)に単独で,または複数の組み合わせで変異を導入して,α鎖と共発現する安定発現細胞を構築し,各変異体の酵素活性,細胞内での存在部位等を観察した.その結果,各ジスルフィド結合は酵素活性の癸現に必須であること,β鎖がα鎖と会合して細胞表面に発現するのに重要な役割を果たすことが明らかになった(Kimura et al., J. Biol. Chem.)
α鎖単独,β鎖単独発現細胞をそれぞれ構築し,細胞内でのα/βオリゴマー形成の調節機構を検討した.その結果,β鎖と会合しなかった過剰のα鎖はERに留められてポリユビキチン鎖修飾を受けてプロテアソームによって分解されることが確認された.一方,β鎖はα鎖の有無に関わらず安定性に大きな変化はなく,過剰のβ鎖も細胞膜表面に発現することが観察された.これらの結果から,細胞表面におけるα/β複合体の発現量はERでのたんぱく質の品質管理機構によって調節されることが明らかとなった(Kimura et al., Biochemistry, in press)
温度感受性の大型T抗遺伝子を導入したラットの胃粘膜上皮細胞を出発材料にして不死化細胞株を構築した.細胞株は温度感受性に上皮様形態をとり,細胞毎に主細胞,壁細胞などに特異的なマーカーのmRNAを発現し,胃粘膜分化機構の研究に有用であることが確認された(Tabuchi et al., Cell Struct. Funct.)

Research Products

• [Publications] Kimura, T. et al.: "Mutational study on the roles of disulfide bonds in the β-subunit of gastric H^+, K^+-ATPase"Journal of Biological Chemistry. 277. 20671-20677 (2002)
• [Publications] Kimura, T. et al.: "Stable expression of gastric proton pump activity at cell surface"Journal of Biochemistry. 131. 923-932 (2002)
• [Publications] Tabuchi, Y. et al.: "Development and characterization of conditionally immortalized gastric epithelial cell lines from transgenic rats harboring temperature-sensitive simian virus 40 large T-antigen gene"Cell Structure Function. 27. 71-79 (2002)
• [Publications] Sakai, H. et al.: "Molecular and pharmacological properties of inwardly rectifying K^+ channels of human lung cancer cells"Eur. J. Pharmacol.. 435. 125-133 (2002)
• [Publications] Tabuchi, Y. et al.: "Identification of genes responsive to sodium butyrate in colonic epithelial cells"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 293. 1287-1294 (2002)
• [Publications] Takahashi, Y. et al.: "Expression of ATP1AL1, a non-gastric proton pump, in human colorectum"Japanese Journal of Physiology. 52. 317-321 (2002)
• [Publications] Asano, S. et al.: "Mutational Analysis of Gastric Proton Pump, α-and β-Subunit. In "Mechanism and Consequences of Proton Transport." By Urushidani, T., Forte, J.G. and Sachs, G."Kluwer Academic Publishers. 59-70 (2002)