2001 Fiscal Year Annual Research Report
生物発光検出法を用いる超高感度多成分同時検出酵素イムノアッセイの開発
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13672431
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
伊藤 克敏 昭和大学, 薬学部, 講師 (20223141)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 教授 (00053869)
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| Keywords | 生物発光 / アセテートキナーゼ / ピルベートフォスフェートジキナーゼ / ADP依存性ヘキソキナーゼ / 高感度同時検出 / 生物発光イムノアッセイ / ホタルルシフェラーゼ / ルシフェリン |
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| Research Abstract |
本申請ではアセテートキナーゼ(AK)とピルベートフォスフェートジキナーゼ(PPDK)が同一反応条件下で異なった基質からATPを生成する性質を利用した両酵素の高感度同時生物発光測定法の検討を行った.今年度は以下の成果を得た.
本法は第1段階でAKによりADPから生じたATPをルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により発光検出しAKの測定を行い,第2段階でADP依存性ヘキソキナーゼ(ADP-HK)とグルコースによりADPをAMPに変換することでAKによるATP産生を抑制させ,同時にPPDKによりAMPからATPを産生させ,それを発光検出することでPPDKの測定を行うことを原理としている.
本法によるAK活性の測定は共存するPPDKの影響はみられず最小検出感度1.03x10^<-20>mol/assay(blank+3SD)であり単独測定と同等の感度が得られた.また,その同時再現性は4.1〜5.2%(CV%,n=8)であった.一方PPDK活性の測定においてAK測定用発光試液中の過剰なADPの消去は8.1mU/mL ADP-HK,20mMグルコースを添加することで最適化され,PPDK測定時のAKによる影響を排除できた.またADP-HKおよびグルコース添加によるPPDKの測定に対する影響はみられなかった.本法によるPPDK活性の最小検出感度は2.05x10^<-20>mol/assay(blank+3SD)であり単独測定と同等の感度が得られた.また,その同時再現性は1.6〜5.7%(CV%,n=8)と良好であった.
次年度は本検出法を高感度2成分同時検出生物発光イムノアッセイに応用を行う.
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