2001 Fiscal Year Annual Research Report
複数ドメインからなるDNA結合タンパク質の構造解析法の開発-クロスリンクと質量分析による解析-
| Project/Area Number |
13680700
|
|---|
| Research Institution | Yokohama City University |
|---|
Principal Investigator |
明石 知子 横浜市立大学, 総合理学研究科, 助教授 (10280728)
|
|---|
| Keywords | クロスリンク / 質量分析 / DNA結合タンパク質 |
|---|
| Research Abstract |
DNAと特異的に結合する転写因子HSF3 DNA結合ドメインと、転写因子c-Myb DNA結合ドメインの相互作用する領域について解析を行った。これらの転写因子は異なる遺伝子の発現を制御するものであるが、HSF3とc-Mybを同時期に発現させるとHSF3を介した遺伝子発現が活性化されること、その活性化に必要なのは両転写因子の各々のDNA結合ドメインであることがわかっている。これら2つのDNA結合ドメインの相互作用領域を、クロスリンクと質量分析を組み合わせた方法で解析を行った。
2つのDNA結合ドメインを1:1のモル比でインキュベーションした後、Lysの架橋試薬であるBS^3(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)を5モル当量加え、室温で反応させた。トリス緩衝液を加えることにより反応をクエンチした後、SDS-PAGEにより目的生成物であるヘテロ2量体を分離した。ヘテロ2量体のバンドをゲルから切り出し、還元アルキル化後、トリプシンでゲル内消化を行った。得られたペプチド混合物について質量を正確に求め、架橋位置の同定を行った。現在、反応条件の最適化および質量のペプチドに対する正確な帰属を試みている。
脂質との相互作用によりもたらされるペプチドやタンパク質の構造変化について、重水素交換後、質量分析を用いて交換されたアミド水素の位置を特定する方法により、得られた結果をまとめた。重水素交換を組み合わせた方法は、複数のドメインからなるタンパク質の構造解析にも応用できるものと考えられる。
|
