トロンビンレセプター特異的33kDaリン酸化酵素の構造・活性相関の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680711
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 井戸 正流 三重大学, 医学部附属病院, 助教授 (90167263)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 宏治 三重大学, 医学部, 教授 (70077808)
• Keywords: トロンビンレセプター / セリン・スレオニンキナーゼ / 血小板 / μ-calpain

Research Abstract

トロンビンレセプターは3種類(PAR1、PAR3、PAR4)存在するが、ヒト血小板ではPAR1とPAR4が発現し、PAR1が主要なトロンビンレセプターとして働いている。PAR1は7回膜貫通構造をもつG蛋白共役型受容体の一つで、トロンビン刺激により活性化され、産生されたIP_3が細胞内Ca^<2+>を上昇させる。これに伴い、PAR1のC末側の細胞内ドメインがリン酸化される。我々は、血小板におけるPAR1の細胞内ドメインを特異的にリン酸化する酵素を調べるために、PAR1の細胞内ドメインを大腸菌にグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として発現させた。この融合蛋白をゲル内リン酸化法のin vitroの基質として用いたところ、血小板内にトロンビン刺激により新たに活性化される33kDaリン酸化酵素が検出された。同じ7回膜貫通構造を持つβアドレナリンレセプターはG protein-coupled receptor kinase 2(GRK2)やGRK3によりリン酸化される。そこで、33kDaリン酸化酵素がGRK2やGRK3と関係があるか否かを調べるために、トロンビン活性化ヒト血小板抽出液からDEAE-Sepharose, Heparin-Sepharoseを用いて、この酵素を粗精製した。GRK2やGRK3に対する抗体を用いたWestern blotting法で粗精製した33kDaリン酸化酵素との反応性を検討したところ、この酵素はこれらの抗体と反応しなかった。また、同じ7回膜貫通構造を持つβアドレナリンレセプターやPAR4の細胞内ドメインはリン酸化しないことから、33kDaリン酸化酵素はPAR1に特異的な細胞内ドメインリン酸化酵素と考えられた。また、この33kDaリン酸化酵素の活性化過程では細胞内Ca^<2+>濃度の上昇が必須であるが、阻害剤を用いた実験よりμ-calpainがこの33kDaリン酸化酵素の活性化に関与していることが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Ido, M.(8人略3人目): "A pivotal role of rho GTPase in the regulation of morphology and function of dendritic cells"J Immunol. 167. 3585-3591 (2001)
• [Publications] Ido, M.(4人略3人目): "Adenosine inhibits thrombin-induced expression of tissue factor on endothelial cells by a nitric oxide-mediated mechanism"Clin. Science. 102. 167-175 (2002)
• [Publications] Ido, M.(7人略5人目): "Bacterial lipopolysaccharide decreases thrombomodulin expression on sinusoidal endothelial cells of rats, which may induce liver dysfunction via microthrombus formation in the sinusoids"J. Hepatol.. 38. 9-17 (2003)
• [Publications] Ido, M.(7人略5人目): "The natural anticoagulant activated protein C inhibits the expression of platelet-derived growth factor in the lung"Am. J. Respir. Crit. Care Med.. 38(In press). (2003)