チャネル分子立体構造-機能相関研究のための大腸菌機能発現プラットフォームの開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680737
• Research Institution: Fukui Medical University
• Principal Investigator: 老木 成稔 福井医科大学, 医学部, 教授 (10185176)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 矢部 勇 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (90111575) ; 清水 啓史 福井医科大学, 医学部, 助手 (50324158) ; 今野 卓 福井医科大学, 医学部, 助教授 (50225637) ; 山田 克幸 福井医科大学, 医学部, 助手 (20313744)
• Keywords: 大腸菌パッチクランプ / KcsAチャネル / 脂質平面膜法 / 単一チャネル電流 / 大腸菌巨大化

Research Abstract

チャネル分子の構造機能相関研究は、Kチャネルの立体構造決定を機に、従来の配列-機能解析が立体構造-機能解析に転換した。この流れをさらに進めるには、大量発現によって結晶化を視野に入れることのできる、原核生物由来のチャネル分子を対象として研究を進める必要がある。チャネル分子の大量発現から機能解析までを共通のプラットフォームである大腸菌で行うことが最も効率的であると考えられる。そのさい問題となるのは大腸菌では効率的な機能解析法が確立していないということであり、本研究では大腸菌で直接パッチクランプ法を使える系の確立を目指した。大腸菌の巨大化について再現性よく実験することができたが、パッチ法に関しては多大な技術的な困難が横たわっていた。これらの問題点は完全には解決されておらず、全細胞記録の成功率は極めて低いというのが現状である。KcsAチャネルを発現させた大腸菌で巨大化は問題なく起こり、電気生理学的実験を行った。観察された電流は単なる膜のリークではないチャネル由来の電流が得られた。ところがこの電流はカリウム選択性でないことから、KcsAではなく内在性チャネル由来と考えられた。一方、同じ大腸菌からKcsAを抽出・精製・再構成し、脂質平面膜法で記録すると単一チャネル電流を観察することができ、KcsAの発現量は十分であると考えられる。脂質平面膜法の中でも精度の高いtip-dip法で単一チャネル電流を記録し、詳細なキネティクス解析を行った。さらに、大腸菌パッチにおいてギガシールしたパッチ膜を切り取った、いわゆるinside-out patchではKcsA電流を記録することができた。つまり単一チャネルレベルではinside-outの大腸菌パッチと脂質平面膜法で記録できたが、全細胞記録となると全くKcsA由来の電流を測定できなかったことになる。この二つの現象の乖離を説明するための実験を現在も続けている。一方、大量発現によるKcsAチャネル結晶化の条件などを探ることができた。

Research Products

• [Publications] W.Uozumi, K.Yamada, S.Goshima, T.Ona, S.Oiki: "Sodium blocking induced by a point mutation at the C-terminal end of the pore helix of KAT1"J.Membrane Biol.. 181. 163-170 (2001)
• [Publications] Horie T, Yoshida K, Nakayama H, Yamada.K, Oiki S, Schroender.J.I, Uozumi N: "Two types of HKT transporters with different properties of Na+ and K+ transport in Oryza sativa"Plant Journal. 27. 129-138 (2001)
• [Publications] Maeser P, Hosoo K, Nakayama H, Oiki S, Schroeder J I, Uozurni N: "Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine Potassium selectivity in four-loop-per-subunit HKT"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 99. 6428-6433 (2002)
• [Publications] Kamatari.Y., Dobson, C.M., Konno, T.: "Structural dissection of alkaline-denatured pepsin"Protein Sci.. 12. 717-724 (2003)
• [Publications] Shimizu, H., Toyoshima, C., Oiki.S: "Interaction between Tetraethylammonium and Permeant Cations at the Inactivation Gate of the HERG Potassium Channel"Jpn.J.Physiol.. 53. 25-34 (2003)
• [Publications] Futaki, S., Zhang, Y., Kiwada, T., Yagami, T., Oiki, S., Sugiura, Y.: "Gramicidin-based Channel Systems for the Detection of Protein-ligand Interaction"Bioorg.Med.Chem.. (In press). (2003)
• [Publications] 老木 成稔: "生物物理ハンドブック"石渡 信一, 桂 勲, 桐野 豊, 美宅 成樹 編 広川書店(印刷中).