機能的発現に補助因子を必要とするG蛋白共役型受容体の発現機構の分子レベルでの解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13680846
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 上園 保仁 長崎大学, 医学部, 講師 (20213340)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷山 紘太郎 長崎大学, 医学部, 教授 (70030898)
• Keywords: GABA-B受容体 / G蛋白共役型受容体 / heterodimerization / Electrophysiology / Xenopus oocyte / heterologous expression / 内向き整流性Kチャネル / CFTR

Research Abstract

申請者らは、GABA-B受容体ならびにAM受容体について、クローン化受容体発現細胞あるいはそれぞれの受容体を発現している組織・細胞を用いてそのシグナル伝達メカニズムについて検討を行ってきた。偶然にも両受容体は、機能的に発現するためには補助蛋白を必要とする受容体であった。GABAB受容体の場合はGABA-B1とGABAB-2というサブタイプがヘテロダイマーを作ることが機能発現に必須であり、AM受容体はCRLRがRAMP2とともに発現することが必須である。
本研究ではこれら補助因子を必要とする受容体の機能的発現のメカニズムについての解明を、クローン化GABA-B受容体、ならびにAM受容体(CRLR+RAMPs)を発現させた細胞を用いて、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いてアッセイし、さらには(3)GABA, AM受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、機能性受容体の発現の分子メカニズムを総合的に解析しようとするものである。
(1)については、現在最適な発現状況を検討しているところであるが、細胞膜上に機能的受容体が発現するときにはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得ている。(2)については、まだ発現の最適化が完全には行われておらず、さらに検討を要している。(3)については、特にGABAB受容体について、GABAB-1R、GABAB2Rを用いてアフリカツメガエル卵母細胞に機能的な受容体を発現させ、GABAの結合に必要な受容体サブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要不可欠なサブタイプについて、どちらがその役割に関与しているかどうか検討している。そのためにGABAB受容体とG-proteinとを融合させたFusion proteinを作製し、これらを発現させ、さらに詳細に解析を試みている。
これら3つのアッセイを組み合わせることで、来年度研究終了時までには当初の自的を完遂できるものと考えている。

Research Products

• [Publications] KAIBARA, M., NAGASE, Y., MURASAKI, O., UEZONO, Y.: "GTP-γS-induced Ca2+-activated Cl-currents : its stable induction by Gqα. overexpression in Xenopus oocytes"Japanese Journal of Pharmacology. 86. 244-247 (2001)
• [Publications] SHIRAISHI, M., MINAMI, K., UEZONO, Y., et al.: "Inhibition by tramadol of muscarinic receptor-induced responses in cultured bovine chromaffin cells and in Xenopus oocytes expressing cloned m1 receptors"Journal of Pharmacol. Exp. Therapeutics. 299. 255-260 (2001)
• [Publications] UEZONO Y., NAKAMURA, E., UEDA, Y.et al.: "Production of cAMP by adrenomedullin in human oligodendroglial KG1C cells : comparison with calcitonin gene-related peptided and amylin"Molecular Brain Reserach. 97. 59-69 (2001)
• [Publications] MINAMI, K., SHIRAISHI, M., UEZONO, Y., et al.: "Inhibitory effects of anesthetics, ethanol and diethyl ether on substance P receptors expressed in Xenopus oocytes"Anesthesia and Analgestics. 94. 79-83 (2002)
• [Publications] MATSUOKA, I., KIMURA, J., UEZONO, Y.: "Involvement of a rapid and localized adenosine formation by ecto-nucleotidases in adenine nucleotide-induced activation of adenosine A2B receptors expressed in Xenopus oocytes"Molecular Pharmacology. (In Press). (2002)
• [Publications] SHIRAISHI, M., MINAMI, K., UEZONO, Y., et al.: "Inhibitory effects of tramadol on nicotinic acetylcholine receptors in adrenal chromaffin cells and in Xenopus oocytes expressing α7 receptors"British Journal of Pharmacology. (In Press). (2002)