2001 Fiscal Year Annual Research Report
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13770119
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
清川 悦子 理化学研究所, スフィンゴ脂質機能研究チーム, フロンティア研究員 (80300929)
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| Keywords | 脂質特異的プローブ / スフィンゴミエリン / リコンビナント蛋白質 / 脂質ラフト / 細胞接着 |
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| Research Abstract |
スフィンゴミエリンに特異的に給合するミミズ毒素ライセニンをGST-あるいはMBP-のタグをN末端につけ、大腸菌で発現・回収する系を確立し、リコンビナント蛋白として得た。NRK細胞をファイブロネクチン・コートしたガラスに撒きなおしインテグリン刺激を加え、経時的に固定し、リコンビナント・ライセニンで染色してスフィンゴミエリンの動態を観察した。刺激後15分では、スフィンゴミエリンは細胞形質膜が波打ちしている場に特異的に濃縮されるが、それは一過的で、刺激後75分では、定常状態と同様の形質膜全体に一様に染まる像が得られた。また、このスフィンゴミエリンの局在は細胞骨格を司るアクチンと共局在するが、細胞接着斑に存在し接着を司る蛋白質であるビンクリン、p130Casなどとは共局在しなかった。また、脂質ラフトの構成分子として重要とされている糖脂質GM1、あるいはカベオリン蛋白質の動態とも異なった。
欠失変異体を作成することで、無毒化リコンビナントライセニンを得たので、これを生きた細胞とインキュベートし細胞外膜のスフィンゴミエリンを標識した後に、ファイブロネクチンコートしたガラスに撒きなおし、細胞接着に及ぼす影響を検討したが、接着能は亢進も減弱もしていない、という結果を得た。
次年度は、無毒化リコンビナントライセニンを蛍光標識し生細胞で経時的に観察するとともに、スフィンゴミエリン領域に集積される蛋白質・脂質を同定していく。
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