新生児慢性肺疾患の病態におけるクララ細胞分泌蛋白の役割に関する検討

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13770626
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 林田 慎哉 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (70276319)
• Keywords: クララ細胞分泌蛋白 / 新生児慢性肺疾患

Research Abstract

Clara cell secretory protein(CCSP)は、気道の非線毛上皮細胞から豊富に発現される蛋白で、その機能と動態は、完全には解明されていない。現在までの研究から、機能に関しては気道での抗炎症作用を持つことが示唆され、動態に関しては気道での炎症時に気道から血液中への漏出が増加するとともに発現量が抑制されることが示唆されている。
極低出生体重児の慢性肺疾患は気道での慢性炎症を病態の中心とする。この疾患におけるCCSPの動態を解明し、抗炎症作用を持つとされるCCSPの補充療法の可能性を探るのが本研究の最終的な目的である。
気管支肺胞洗浄液中のCCSPを計測するELISAシステムの確立から研究を開始した。最初に抗体製作とELISAのコントロールのためのrecombinant CCSPの発現と精製を行った。ラットCCSPのcDNAを発現ベクターに組み込み、大腸菌にトランスフェクションした。トランスフェクションされた大腸菌はisopropyl-β-D-thiogalactopyranosideを加えることにより、多量のrecombinant rat CCSP(rrCCSP)を発現した。rrCCSPの発現は、Western blot analysisによって確認された。大腸菌を超音波によりリン酸バッファー中で溶菌したが、バッファー中にはrrCCSPは存在せず、沈殿物中に存在することが確認された。沈殿物中のrrCCSPをTriton等で可溶化させようと試みたが、尿素によってのみ可能であった。rrCCSPはpolyhistidine tagを含むため、尿素を用いて可溶化した後、ニッケルを固定したアガロースゲルによるアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。精製したrrCCSPは多量のLPSを含んでいた。ポリミキシンBカラムを用いてLPSの除去を試みたが、rrCCSPも吸着されてしまった。最終的にゲルクロマトグラフィーを繰り返すことでLPS含有量を大幅に減じることに成功した。

Research Products

• [Publications] Mori K, Ikeda K, Hayashida S, Tokieda K, Ishimoto H, Fujii Y, Fukuzawa R, Kitano Y: "Pulmonary epithelial cell maturation in hyperplastic lungs associated with fetal tracheal agenesis"J Pediatr Surg. 36・12. 1845-1848 (2001)