S.sobrinus gtf遺伝子発現株によるバイオフィルム形成機序の解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13771082
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 桑原 紀子 (篠崎 紀子) 日本大学, 松戸歯学部, 副手 (90287665)
• Keywords: バイオフィルム / S. anginosus形質転換株 / gtf遺伝子 / S. sobrinus

Research Abstract

本研究は、ヒトロ腔より齲蝕原性細菌の一つとして分離されるStreptococcus sobrinusが産生する4種のグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)の相互作用による齲蝕誘発性バイオフィルム形成メカニズムの解明を最終目標としてS. sobrinus B13N株染色体よりGTFをコードするgtf遺伝子を非齲蝕誘発性口腔細菌のStreptococcus anginosusへ導入した4種のgtf遺伝子(gtfI,U,T,S)単独発現株を作製し、これらを用いて齲蝕試験を行うことを目的としている。目的達成のため、平成13年度は主として、S. sobrinusが有する4種のgtf遺伝子のうち、B13N株より唯一クローニングされていないgtfT遺伝子を大腸菌プラスミドへクローニングとS.anginosus gtfT遺伝子発現株の作製を試みた。まずB13N株より染色体DNAを調製し、これを鋳型としてPCRを行った。使用したプライマーはすでに報告されているS. sobrinus OMZ176株gtfT遺伝子の塩基配列をもとにして設計した。その結果、ほほ予想された大きさのDNA断片が増幅された。この断片を各種制限酵素にて切断してみたところ、OMZ176株のパターンとほぼ一致したためこのPCR断片がgtfT遺伝子であることを確認した。しかしながらこの断片の大腸菌プラスミドへのクローニングを数回繰り返して試みたが、ついにこの断片が挿入されたプラスミドを有する大腸菌クローンを得ることができなかった。
そこで方針を変更し、gtfT遺伝子を二分割してPCRで増幅して別々にクローン化することとし、プライマーの再設計を行った。この際、遺伝子の一部が重複するように留意した。PCRを行ったところ予想された大きさの断片が得られた。これらを別々のS. anginosus形質転換株作製用のプラスミドへ導入し、両断片ともにクローン化に成功した。これらの大腸菌クローンよりプラスミドを回収し、制限酵素処理によりプラスミドを直鎖とした後、S. anginosusを順次形質転換した。その結果、いくつかの形質転換株を得ることに成功した。これらの株の培養上清からリコンビナント酵素を部分精製し、SDS-PAGE後、特異抗体を用いた免疫染色と活性染色を行ったところ、抗体に反応しかつ活性を有した酵素を産生する形質転換株であることを確認した。