エストロジェン受容体の発現とその共役因子の活性の制御による新規骨疾患治療法の確立

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13771092
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 石橋 宰 新潟大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (70293214)
• Keywords: エストロジェン / エストロジェン受容体 / 遺伝子プロモーター / BMP / 機械的刺激 / Cキナーゼ

Research Abstract

1.ヒトERα、ERβ遺伝子プロモーターの活性調節を行う物質や因子の検索
ヒトの両ER遺伝子プロモーター配列のPCRによる単離については、増幅条件の最適化が予想外に困難であり、現在も進行中である。そこで、マウスの同遺伝子プロモーターの増幅も同時に試みた。既知のマウスERα遺伝子プロモーターの部分配列をPCR増幅することで得た断片をプローブとして用い、約2.8kbpの断片を得た。また、マウスERβ遺伝子プロモーターについては、mERβ cDNAの5'-末端領域断片をプローブとして同様にスクリーニングを行い、プロモーター領域を含む約1.2 kbpの断片を単離した。次に、得られた各ERサブタイプの遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結し、さらにneo^r遺伝子を組み入れたレポータープラスミドを構築した。これらを骨芽細胞様細胞株MC3T3-E1に安定的に導入した。これらの細胞に各種ホルモンや薬剤およびフレクサーセルを用いて機械的刺激を加え、細胞を回収した後ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、BMP2、EGF、およびTPAなどは両遺伝子プロモーターを有意に抑制し、実際これらの薬剤はMC3T3-E1細胞において両ERサブタイプmRNAの発現も減弱することが明らかになった。一方機械的刺激の効果は今回の条件設定では認められなかった。この中で、BMP2は骨芽細胞の分化や機能に特異的に関与する因子であるため、さらなる解析を進めた。その結果、BMP2は新規蛋白質合成を介して両ER遺伝子の発現を抑制するが、ERα、ERβ各遺伝子発現の抑制は、それぞれCキナーゼ依存的、非依存的にもたらされることが示された。
2.骨組織特異的なER共役因子の検索
酵母ツーハイブリッドの実験系により、現在までにいくつかのER結合蛋白質の候補遺伝子を得ている。現在これらについてさらなる解析を進めている。

Research Products

• [Publications] 石橋 宰: "Cloning and characterization of the functional promoter of mouse estrogen receptor beta gene"Biochim. Biophys. Acta. 1519・3. 223-229 (2001)
• [Publications] 石橋 宰: "Tamoxifen agonism and estrogen antagonism of c-fos gene promoter activity through non-consensus-responsive elements in MC3T3-E1 osteoblasts"Biochem. Biophys. Res. Commun. 289・3. 705-711 (2001)