イノシトールリン脂質を介したエンドサイトーシス制御機構の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13780567
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 伊藤 俊樹 東京大学, 医科学研究所, 助手 (30313092)
• Keywords: epsin / トランスゴルジ網 / クラスリン / ENTHドメイン / AP-1 / イノシトールリン脂質

Research Abstract

昨年度の本研究において明らかにした、新規epsinファミリーに属するKIAA0171のさらに詳細な機能解析を行った。
KIAA0171の細胞内局在は、クラスリンだけでなく、トランスゴルジ網(TGN)輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致した。また、その一部はエンドソームの融合によって生じるMVB(multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することが観察された。実際、in vitroでのpull-down assay及びoverlay assayにより、KIAA0171は一次構造中央部においてクラスリン重鎖、及びγ-adaptinと結合することが明らかとなった。さらに詳細な部分コンストラクトを作製し、検討したところ、これらの結合はそれぞれ、(1)KIAA0171の「SGDLVDLSGDLVDLGFVG」配列とクラスリン重鎖末端ドメイン、及び(2)KIAA0171の「GNGDFGDWSA」配列とγ-adaptinのearドメインとの相互作用によるものであることが明らかとなった。
次に、KIAA0171の細胞内局在とENTHドメインの関係を明らかにするべく、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損するとKIAA0171のTGN周辺への局在が観察されないことは昨年度に明らかにしていたが、脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様に、細胞質中に分散する異常な局在パターンを示した。驚くべきことに、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。

Research Products

• [Publications] Toshiki Itoh, Tadaomi Takenawa: "Phosphoinositide-binding domains : Functional units for temporal and spatial regulation of intracellular signalling"Cellular Signalling. 14・9. 733-743 (2002)
• [Publications] Makiko Otsuki, Toshiki Itoh, Tadaomi Takenawa: "N-WASP is recruited to rafts and associates with endophilin A in response to EGF"The Journal of Biological Chemistry. (in press). (2003)