2001 Fiscal Year Annual Research Report
生理活性ペプチドの新たな分子設計をめざしたランチビオティックの生化学研究
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13876024
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
園元 謙二 九州大学, 大学院・農学研究院, 教授 (10154717)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 弘美 熊本県立大学, 環境共生学部, 講師 (30326491)
土居 克美 九州大学, 大学院・農学研究院, 講師 (40253520)
小林 元太 九州大学, 大学院・農学研究院, 助手 (40291512)
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| Keywords | ランチビオティック / バクテリオシン / nukacin ISK-1 / Staphylococcus warneri ISK-1 / ランチオニン形成酵素 / 生合成酵素複合体 / 転写制御機構 |
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| Research Abstract |
Staphylococcus warneri ISK-1が生産するランチビオティック、nukacin ISK-1について検討した。
1.生合成遺伝子の機能解析:これまで断片的に取得した遺伝子群(nukA, nukM, nukT, nukF, nukE, nukG, orf1, orf7)を再構築し、シャトルベクターにクローニングした。しかしながら、nukacin ISK-1を発現する形質転換体は得られなかった。また、組換えプラスミドを導入した菌において、nukA(nukacin ISK-1前駆体をコードする遺伝子)が転写されていないことが明らかとなった。この結果から、nukacin ISK-1の発現には、nukAの転写調節に関与する他の遺伝子が存在する可能性が示唆された。
2.修飾酵素NukMの精製と局在性:大腸菌で発現させたHis-tag-NukM融合タンパク質を抗原として、抗NukM抗体を作製した。LanMタイプのランチオニン形成酵素としては世界で始めての成功である。ウエスタン解析の結果、NukMは細胞膜に結合していた。
3.生合成に関与するタンパク質の相互作用の解析:酵母のTwo-hybrid systemを用いた結果、NukM、輸送タンパク質NukTはそれぞれ2分子以上が複合体を形成し、NukAはNukMのN末端領域、C末端領域、およびNukTのN末端領域と相互作用していることが示された。これらの生合成酵素複合体は細胞膜に結合していることが示唆された。
4.転写制御機構の解明:生合成遺伝子群の転写単位は、orf1、nukAおよびnukMTFEG-orf7の3つであることが明らかとなった。後者2つのオペロン転写開始点の上流には、いずれも大腸菌のσ^<70>認識プロモーター様の配列が確認された。また、その周辺にresponse regulatorが結合するための明確な反復配列は存在していなかった。
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[Publications] 園元謙二, 指原紀宏: "乳酸菌のバクテリオシンの構造と作用機構"蛋白質核酸酵素. 46・4. 323-332 (2001)
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[Publications] 園元謙二, 石崎文彬: "乳酸菌を利用する食品にやさしい殺菌方法-バイオプリザベーション-"生物工学. 79・6. 182-185 (2001)
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[Publications] Toshihiro Sashihara et al.: "The effect of osmotic stress on the production of nukacin ISK-1 from Staphylococcus warneri ISK-1"Appl. Microbiol. Biotechnol.. 56・3-4. 496-501 (2001)
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[Publications] Ayaaki Ishizaki et al.: "Taxonomic position of new bacteriocin (nukacin ISK-1) producer isolated from long-aged Nukadoko"J. Gen. Appl. Microbiol.. 47. 143-147 (2001)
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[Publications] Said Ennahar et al.: "Biochemical and genetic evidence for production of enterocins A and B by Enterococcus faecium WHE 81"Internat. J. Food Microbiol. 70・3. 291-301 (2001)
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[Publications] 善藤威史, 中山二郎, 園元謙二: "バイオプリザベーション-乳酸菌バクテリオシンの利用-"化学工業. 53・2. 94-100 (2002)
