生殖毒性評価・後代検定技術としての生殖細胞系列の完全連続培養技術の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13876059
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 佐藤 英明 東北大学, 大学院・農学研究科, 教授 (80093243)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 浩道 東北大学, 大学院・農学研究科, 助手 (70241552) ; 佐々田 比呂志 東北大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (90158931)
• Keywords: ヒアルロン酸 / 卵子形成 / MAPキナーゼ / HAS2 / HAS3 / fas欠損マウス / CD44 / アポトーシス

Research Abstract

1)マウスとブタの透明帯にFas・Fasリガンドシステムの発現を抑制する効果があることをすでに明らかにしているが、このような透明帯の機能はヒアルロン酸である可能性が高いことを明らかにした。卵子の死滅過程でMAPキナーゼが活性化すること、活性化のプロファイルは成熟過程でのプロファイルと同じであることを明らかにした。一方、HAS3のcDNAの構造を明らかにした。さらにHAS2,HAS3のゲノムDNAの解析を進め、HAS2について、Inverse PCR法により、翻訳開始コドンであるATGより上流域1.2kbpのゲノムDNAの塩基配列を明らかにした。この配列を解析したところ、ATGの直前にイントロンの存在を確認できた。
2)2次元電気泳動により、少なくとも5種のヒアルロン酸結合タンパク質が同定されたが、感度を上げFITC標識ヒアルロン酸をリガンドとして検出すると電気泳動上のバンドとして14本(先に同定したバンドを含む)同定できた。しかし、卵胞の発達との相関についてみると85kDaのバンドのみが変化した。免疫沈降法などによって解析を進めた結果、85kDaのバンドはすでに同定しているCD44であることが明らかとなった。そこでCD44の機能に焦点をあてて解析を進め、CD44が顆粒膜細胞に発現し、卵子と顆粒膜細胞のギャップ結合蛋白質(コネクシン)の発現に関与すること、また、ヒアルロン酸とCD44の結合が卵子の成熟開始の引き金になることを発見した。また、ヒアルロン酸・CD44系がアポトーシス抑制にも係わる可能性を明らかにした。さらに、卵子の死滅過程でMAPキナーゼが活性化すること、活性化のプロファイルは成熟過程でのプロファイルと同じであることを明らかにした。
3)fas欠損マウスでは卵胞閉鎖が抑制され、潜在的排卵可能卵子が増加することをすでに明らかにしている。このような結果を踏まえ、fas遺伝子ノックアウトブタ作出に向けて、ブタfascDNAの同定で成功し、現在、ゲノムDNAの解析を行っている。すでに樹立した胚由来細胞や胎子繊維芽細胞を用いる遺伝子ノックアウトの条件は決定している。

Research Products

• [Publications] 佐藤英明: "Establishment of an in vitro production system for unclear transfer embryos reconstituted with cultured cells in pigs"J.Reprod.Dev. 47(Suppl.1). 41-45 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "Molecular basis of oocyte maturation in culture in the pig"J.Reprod.Dev. 47(Suppl.1). 63-69 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "Characteristics of infertility in female hypothyroid(hyt) mice"Reproduction. 122. 695-700 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "Parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro"Mol.Reprod.Dev. 61. 120-125 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "Evaluation of bull fertility by migration of frozen-thawed and washed sperm in medium containing cervical mucus"J.Reprod.Dev. 47. 393-398 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "Vitrification of large quantities of immature bovine oocytes using nylon mesh"Cryobiology. 42. 139-144 (2001)
• [Publications] 佐藤英明: "卵子研究法"養賢堂. 405 (2001)