可逆性不死化ヒト肝細胞を用いたプロテオーム解析による不死化機構の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13877024
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 米澤 一仁 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (70283900)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 紀章 岡山大学, 医学部, 教授 (10127566) ; 吉野 健一 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (90280792) ; 原 賢太 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (70294254)
• Keywords: 可逆性不死化細胞 / ヒト肝細胞 / プロテオーム解析 / 質量分析計 / 不死化機構

Research Abstract

細胞の不死化は生物学上の大きな問題であり、これから研究を推し進める必要のある重要分野である。初代培養ヒト肝細胞由来で、可逆性に不死化をコントロールできる細胞株NKN-T3細胞を用いて、可逆的に不死化をコントロールし、その時の蛋白質の変動をプロテオーム的アプローチにより網羅的に解析し、未知の不死化機構の解明を試みることが本研究の目的である。研究経過を以下に示すと、(1)NKN-T3細胞由来の蛋白質の同定を、2次元電気泳動法で試み、蛋白質同定に最適な2次元電気泳動法の条件の確立に成功した。が、可逆的に不死化に伴う蛋白質スポットの量の変動の再現性を得るのに困難を極め、結局この方法による変動蛋白質の同定は断念。(2)次に、NKN-T3細胞由来の蛋白質を分画し、SDS-PAGEによる一次元電気泳動での分離した。蛋白質のバンドを切り取りゲル内消化後、ESI-Q-TOF質量分析装置によるマスペプチドフィンガープリンテイング法による解析を行った。この手法により蛋白質を同定することに成功した。現在、NKN-T3細胞を不死化状態から増殖がとまる状態に転換することによって、いかなる蛋白質の発現変動が観察されるか検討中である。(3)また、このNKN-T3細胞は血清の存在、非存在下で肝細胞としての機能を喪失したり、回復したりという性質を有している。そこで、血清の存在、非存在下で細胞を処理し、その抽出物を(2)と同じ手法で解析し、現在変動する蛋白質の解析を行っている。

Research Products

• [Publications] Minami T.: "Distinct regulatory mechanism for p70 S6 kinase β form that for p70 S6 kinase α"Genes to Cells. 6・11. 1003-1015 (2001)
• [Publications] Takei N.: "Brain-derived neurotrophic factor enhances neuronal translation by activating multiple initiation processes"J. Biol. Chem.. 276・46. 42818-42825 (2001)
• [Publications] Wu S.: "Characterization of ubiquilin 1, an mTOR-interacting protein"Biochim. Biophys. Acta. 1542・1-3. 41-56 (2002)
• [Publications] Avruch J.: "The p70 S6 kinase integrates nutrient and growth signals to control translational capacity"Springer-Verlag. 40 (2001)