多機能型生合成酵素を利用した天然物ライブラリーの構築

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13877362
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 海老塚 豊 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (90107384)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 折原 裕 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (30137905)
• Keywords: 天然物 / 光蔵多様性 / トリテルペン / ポリケタイド / 生合成酵素 / 形質転換植物 / キメラ

Research Abstract

(1)新規多機能型生合成酵索のクローニング
熱帯産ショウガ科薬用植物Costus speciosus のin vitro培養植物体全草よりRNAを抽出、逆転写して得たcDNAを鋳型とし、既知オキシドスクワレン閉環酵素で保存されている配列を基にデザインした縮重プライマーを用いるPCRにより新規トリテルペン合成酵素をクローニングした。酵母における発現により本酵素はβ-Amyrinを含め最低6種の異なる骨格のトリテルペンを与える多機能型生合成酵素であることを証明した。
(2)糸状菌由来ポリケタイド合成酵素間のキメラ型酵素作成とその機能解析
Aspergillus nidulans由来ヘプタケタイド合成酵素WAとドメイン構造が全く同一のウリ類炭素病菌Colletotrichum lagenarium由来のペンタケタイド合成酵素PKS1とのキメラタンパクを作成した。このキメラ酵素をAsp.oryzaeで発現したところ、本来の生成物であるナフトピロンやT4HNは全く生産されず、既知のペンタケタイド2種及びヘキサケタイド1種の他、新規ヘキサケタイドの生産を確認し、目的とする多機能型生合成酵素の作成に成功した。また、微量ではあるがこれらの硫酸エステルの生産も確認したが、これらはホスト糸状菌による硫酸胞合体と考えられる。
(3)生合成遺伝子導入植物の作成
生合成遺伝子導入のモデルとして、ルペオール合成酵素をアンチセンス向きに組み込んだ形質転換用ベクターを作成し、シロイヌナズナを形質転換した。形質転換体を選抜、形質転換第2代目までの植物でトリテルペン系化合物を分析したところルペオール合成のみが選択的に抑制されていることが判明した。

Research Products

• [Publications] A.Watanabe: "A Novel Hexaketide Naphthalene Synthesized by a chimeric Polyketide Synthase Composed of Fungal Pentaketide and Heptaketide Syntheses"Tetrahedron Lett.. 43. 843-846 (2002)
• [Publications] N.Kawano: "Molecular Cloning and Functional Expression of cDNAs Encoding Oxidosqnalene Cyclrses from Costus speciosms"Boil. Pharm. Borll.. 25(4)(発売予定). (2002)