低分子量GTP結合蛋白質ARFの活性型の定量法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13878124
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 中山 和久 筑波大学, 生物科学系, 助教授 (40192679)
• Keywords: GGA / ARF / X線結晶構造解析 / 小胞輸送 / ARF-GEF / アダプター

Research Abstract

低分子量GTP結合蛋白質ARFは,オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは,グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に,形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され,ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し,蛋白質輸送が完了する。つまり,細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。
これまでのところ,細胞内でGTP型のARFのみを特異的に検出する方法はない。しかし我々は最近,GTP型ARFとのみ結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し,GGA分子の中央にあるGGAHドメインがARFとの結合に関与することを示した。そこで本研究では,このGGAHドメインを利用して,細胞でのARFの活性化機構について調べた。
1.GGAのGGAHドメインとGTP結合型のARFとの相互作用について,GGAHドメインの種々の変異体を作製し,相互作用の詳細を明らかにした。また,GGAHドメインのX線結晶構造解析を行い,その立体構造を明らかにした。
2.ARF-GEFの一種BIG2が細胞内でARFを活性化し,トランスゴルジネットワークでのクラスリン/AP-1コート小胞の形成に関与することを証明した。その際に,GGAのGGAHドメインを用いて,細胞内で実際にARFがBIG2により活性化されることを示した。
3.別のARF-GEFであるGBF1が細胞内でARFを活性化し,シスゴルジでのCOPIコート小胞の形成に関与することを証明した。

Research Products

• [Publications] Takatsu, H., et al.: "Similar subunit interactions contribute to assembly of clathrin adaptor complexes and COPI complex : analysis using yeast three-hybrid system"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 284. 1083-1089 (2001)
• [Publications] Ohnishi, J., et al.: "Cloning and characterization of a rat ortholog of MMP-23 (matrix metalloproteinase-23), a unique type of membrane-anchored matrix metalloproteinase and conditioned switching of its expression during the ovarian follicular development"Mol. Endocrinol.. 15. 747-764 (2001)
• [Publications] Kuwabara, T., et al.: "Significantly higher activity of a cytoplasmic hammerhead ribozyme than a corresponding nuclear counterpart : engineered tRNAs with an extended 3 ' end can be exported efficiently and specifically to the cytoplasm in mammalian cells"Nucleic Acids Res.. 29. 2780-2788 (2001)
• [Publications] Takatsu, H., et al.: "Golgi-localizing, γ-adaptin ear homology domain, ADP-ribosylation factor-binding (GGA) proteins interact with acidic dileucine sequences within the cytoplasmic domains of sorting receptors through their Vps27p/Hrs/STAM (VHS) domains"J. Biol. Chem.. 276. 28541-28545 (2001)
• [Publications] Shiba, S., et al.: "Structural basis for acidic-cluster dileucine sequence recognition by GGA1"Nature. 415. 937-941 (2002)
• [Publications] Shinotsuka, C., et al.: "Overexpression of an ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factor, BIG2, uncouples brefeldin A-induced adaptor protein-1 coat dissociation and membrane tubulation"J. Biol. Chem.. 277(In press). (2002)