GFPトランスジェニックマウスを用いた生物時計の可視化と再構成

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13878136
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 村田 昌之 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 助教授 (50212254)
• Keywords: 概日リズム / GFP可視化 / トランスジェニックマウス / 初代培養細胞 / セミインタクト細胞

Research Abstract

哺乳類の概日リズム(サーカディアンリズム)発振の分子メカニズムを明らかにするため、マウス時計遺伝子mPer遺伝子上流配列(プロモーター領域を含む)にレポーター遺伝子としてd1-GFP遺伝子(改変型GFP)を繋いだ遺伝子(mPer-d1-GFP)を作成し、mPer-d1-GFP遺伝子を持ったトランスジェニックマウスを作成した。d1-GFPとは、哺乳類細胞内で半減期約1時間で分解を受ける改変型のGFPである。そのため、mPer遺伝子を発現する臓器の細胞内で、約一時間だけ蛍光を発することができる。つまり、トランスジェニックマウスのSCNニューロン及びmPer遺伝子を発現している臓器(の細胞)は、概日リズムと同期して蛍光を発することになる。作成したトランスジェニックマウスの初期培養SCNニューロンは、自家蛍光が強いがそれをバックグラウンドとして周期的な(概日リズムに対応した)蛍光を発することを確認した。今回の研究期間中には、マウスの作成、その系統維持。初代培養細胞での概日リズム確認までを行った。この間に、いろいろな時計関連遺伝子が同定されまたその遺伝子産物間の相互作用などが次々と明らかのなってきている。今後、これら同定された遺伝子産物のGFP融合タンパク質(または、GFP変異体融合タンパク質、CFP,YFPなど)を無細胞系タンパク質発現系を用いて発現・精製し、セミインタクトSCN細胞を用いた単一細胞レベルでの「時計」の再構成系を構築する予定である。現在、共同研究により、gene chipを用いた時計遺伝子の網羅的解析と変動遺伝子の抽出、抽出遺伝子産物の無細胞タンパク質発現系を用いた発現システムの構築を進めている。

Research Products

• [Publications] Uchiyama Kenji: "VCIP135, a novel essential factor for p97/p47-mediated membrane fusion, is required for Golgi and ER assembly in vivo"Journal of Cell Biology. 159. 855-866 (2002)
• [Publications] Tanaka Arow: "Effect of mutations of ABCA1 in the first extracellular domain on subcellular trafficking and ATP binding/hydrolysis"Journal of Biological Chemistry. 278. 8815-8819 (2003)
• [Publications] 田中亜路: "哺乳動物細胞オルガネラの細胞周期依存的ダイナミクス"生物物理. 241. 116-121 (2002)
• [Publications] 加納ふみ: "細胞内小胞輸送ネットワークの可視化解析"実験医学. 20. 961-967 (2002)
• [Publications] 村田昌之: "よくわかる細胞内輸送"エンドサイトーシスの分子メカニズム. 45-53 (2002)