染色体の動態制御機構による多様な生命体の維持・継承

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13CE2006
• Research Category: Grant-in-Aid for COE Research
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 柳田 充弘 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (80025428)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西田 栄介 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (60143369) ; 竹安 邦夫 京都大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (40135695) ; 武田 俊一 京都大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60188191) ; 石川 冬木 東京工業大学, 大学院・生命理工学研究科, 教授 (30184493)
• Keywords: 生命継承 / 染色体 / 細胞周期 / 修復 / 組み換え

Research Abstract

<柳田研>分裂酵母有糸分裂制御因子についての解析
(1)微少管結合タンパク質Dis1が動原体タンパク質であることを見いだした。この動原体局在は有糸分裂期中期後期特異的であることから、Dis1タンパク質は分裂期において動原体と動原体微少管をつなぎとめる分子であると考えられる。
(2)姉妹染色分体問結合タンパク質Mis4およびRad21について、これらの遺伝子の変異株における分裂期進行遅延表現型を観察し、これらの分子が分裂期初期の動原体と動原体微少管の確立に機能することを明らかにした。
(3)Cut17タンパク質がBIRタンパク質であることを見いだし、さらにその局在の細胞周期変化の解析により、染色体パッセンジャータンパク質であることを見いだした。
<武田研>ニワトリBリンパ細胞株、DT40を使ったDNA組み換え機構の解析
(1)大腸菌RecAの、真核細胞でのホモログであるRad51と相互作用する分子群(Rad51B/C/D、XRCC2/3、Rad52、Brca1/2)の機能の解析を、それらの遺伝子の欠失細胞を作製することによって行った。
(2)姉妹染色分体間結合タンパクコンプレックス(コヒーシン)の構成因子の1つであるrad21/Scc1の欠損細胞を作製することによって、コヒーシンが姉妹染色分体間の相同DM組み換えに重要であることを開明した。
<竹安研>原子間力顕微鏡(AFM)を使った染色体構成因子の観察
平成12年度までに達成されていた数kbのDNA上でのクロマチン再構成技術を発展させて、より高次な構造の解析の材料とするために、ヒト21番染色体のセントロメア領域のアルフォイドDNA(100kb)を含むプラスミドを用いてクロマチンを再構成して原子間力顕微鏡で可視化することに成功した。細胞内でいかにしてDNAが高次構造を形成するかを理解するには、DNA結合性タンパク質の複合体としての詳細な機能を明らかにすることに加え、DNAの物理化学的性質やそれに対するDNA結合性タンパク質の結合影響を理解することが必須である。そこで、ゲノム高次構造構築の一般的原理を探索するという意味で、原核生物のゲノム高次構造を可視化・解析することは有意義であると考えた。ガラスや雲母などの基盤に大腸菌を貼り付け、細胞壁と細胞膜を非常に穏やかに取り除いてゆくと、内部のゲノムが周囲に広がる。これをAFMなどで観察すると、 様々な段階のゲノムの高次構造を観察することができた。これまで、細菌のゲノムは、ヒストンからなるヌクレオソームを形成していないので、真核細胞のゲノムのモデルにはなり得ないと考えられていた。しかし、真核細胞でも原核細胞でも、DNAの構造は同じであり、おなじ性質を持っている。また、真核細胞で見られる染色体の構造形成に関わるタンパク質のホモログが細菌でも数多く見つかっている。さらには、細菌においてもヌクレオソーム様構造やループ領域などが存在するという事実は、「真核細胞、原核細胞を問わず、ゲノムはヌクレオソーム様構造をとりながら、DNA結合性タンパク質の複合体により足場でまとめ上げられていることを示している。真核生物のゲノム高次構造は、基本的には原核生物のゲノム高次構造と同様な原理で、すなわち、DNAの物理的性質とDNA・タンパク質相互作用のバランスの上に構築されると考えられる。
<西田研>M期でのPolo-like kinase 1(Plk1)の機能・細胞内局剤の解析
MPFの主要な活性化因子Cdc25Cが核外移行シグナル(NES)と14-3-3タンパク質との結合により、G2期での細胞質局在が規定されており、M期前期になるとMES中のセリン残基(Ser198,ヒトCdc25Cの配列)がPolo-like kinase 1(Plk1)によってリン酸化されることによって核内移行の引き金が引かれることがわかった。またPlk1がS期からG2期にかけて核と細胞質両方に存在し、M期ではキネトコア領域さらにはmidzone領域に局在が変化していくことが示された。以上、Plk1の機能と局在について新たな知見が得られ、Plk1がM期制御因子として重要な役割を果たすことが、哺乳類細胞においても示された。
<石川研>分裂酵母、ヒト細胞、Xenous卵抽出液無細胞系を使ったテロメア構成タンパクの解析
(1)分裂酵母テロメア結合蛋白質spRap1を同定し、これが既に知られている分裂酵母テロメアDNA結合蛋白質Taz1によってリクルートされて、テロメアに局在すること、rap1破壌株は、taz1破壊株と同じ表現型を示すことから、Taz1はRap1を介してテロメア機能を果たしていることを示した。また、これらの成果より、ヒトテロメア機能の研究上、分裂酵母は出芽酵母よりも適したモデル生物であると考えられた。
(2)ヒト細胞における、細胞分裂ごとのテロメア短小化(末端複製問題)を直接的に解析するために、SV40T抗原によって開始される線状SV40 DNAの試験管内線状DNA複製系を開発し、ラギング鎖合成によって一回約75塩基対のDNAが末端から失われることを示した。
(3)Xenopus卵抽出液無細胞系によるテロメア機能再構成系を開発することを目的として、Xenopusテロメレース触媒サブユニットxTERTを同定し、解析した。

Research Products

• [Publications] Aono, N., Sutani, T., Tomonaga, T., Mochida, S., Yanagida, M.: "Dual Roles of Cnd2lBarren, a Non-SMC Subunit of Condensin, in Mitotic Condensation and Interphase"Nature. (in press).
• [Publications] Toyoda, Y., Furuya, K., Goshima, G., Nagao, K., Takahashi, K., Yanagida, M.: "Requirement of chromatid cohesion proteins rad21/scc1 and mis4/scc2 for normal spindle-kinetochore interaction in fission yeast"Curr.Biol.. 12. 347-358 (2002)
• [Publications] Nagao, K., Yanagida, M.: "Regulating sister chromatid separation by separase phosphorylation"Dev. Cell.. 2. 2-4 (2002)
• [Publications] Goshima, G., Yanagida, M.: "Time course analysis of precocious separation of sister centromeres in budding yeast: continuously separated or frequently reassociated?"Genes Cells. 6. 756-773 (2001)
• [Publications] Morishita, J., Matsusaka, T., Goshima, G., Nakamura, T., Tatebe, H., Yanagida, M.: "Bir1/Cut17 moving from chromosome to spindle upon the loss of cohesion is required for condensation, spindle elongation and repair"Genes Cells. 6. 743-763 (2001)
• [Publications] Nakaseko, Y.Goshima, G., Morishita, J., Yanagida, M.: "M phase-specific kinetochore proteins in fission yeast Microtubule-associating Disi and Mtc1 display rapi"Curr.Biol. 11. 537-549 (2001)
• [Publications] Nakaseko, Y, Yanagida, M.: "Cell biology. Gytoskeleton in the cell cycle"Nature. 412. 291-292 (2001)
• [Publications] M.Takata, M.S.Sasaki, S.Tachiiri, T.Fukushima, E.Sonoda, D.Schild, L.H.Thompson, S.Takeda: "Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs"Mol.Cell.Biol.. 21. 2858-2866 (2001)
• [Publications] T.Fukushima, M.Takata, C.Morrison, R.Araki, A.Fujimori, M.Abe, K.Tatsumi, M.Jasin, P.K.Dhar, E.Sonoda, T.Chiba, S.Takeda: "Genetic analysis of the DNA-dependent protein kinase reveals an inhijbitory role of Ku in late S-G2 phase DNA double-strand break"Jornal of Biological Chemistry. 276. 44413-44418 (2001)
• [Publications] Sonoda, E., Matsusaka, T., Morrison, C., Vagnarelli, P., Hoshi, O., Ushiki, T., Nojima, K., Fukagawa, T., Waizenegger, I.C., Peters, J.-M., Earnshaw, W.C., Takeda, S.: "Scc1/Rad21/Mcd1 is required for sister chromatid cohesion and kinetochore function in vertebrate cells"Developmental Cell. 1. 759-770 (2001)
• [Publications] E.Sonoda, C.Morrison, Y.M.Yamashita, M.Takata, S.Takeda: "Reverse genetic Studies of homologous DNA recombination using the chicken B lymphocyte line, DT4O"Philosophical Transactions of the Royal Society Series B. 356. 111-117 (2001)
• [Publications] E.Sonoda, M.Takata, Y.M.Yamashita, C.Morrison, S.Takeda: "Homologous DNA recombination in vertebrate cells"Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 98. 8388-8394 (2001)
• [Publications] P.K.Dhar, E.Sonoda, A.Fujimori, Y.M.Yamashita, S.Takeda: "Experimental evidence in support of chicken DT4O cell line as a unique model for DNA repair studies"The Journal of Environmental Pathology, Toxicology and Oncology. (in press). (2001)
• [Publications] S.H.Yoshimura, K.Hizume, A.Murakami, T.Sutani, K.Takeyasu, M.Yanagida.: "Condensin Architecture and Intaraction with DNA: Regulatory Non-SMC Subunits Bind to SMC Heterodimer and Restrain its Assembly on DNA"Current Biology. 19. 508-513 (2002)
• [Publications] 吉村成弘, 竹安邦夫: "原子間力顕微鏡と分子生物学の接点〜遺伝子のナノバイオロジー〜"電子顕微鏡. 36. 182-188 (2001)
• [Publications] Sakaue, S., K.Yoshikawa, S.H.Yoshimura, K.Takeyasu: "Histone Core Slips along DNA and Prefers Positioning at the Chain End"Phys. Rev. Lett.. 87. (2001)
• [Publications] Toyoshima-Morimoto, F., Taniguchi, E., Nishida, E.: "Plk1 promotes nuclear translocation of human Cdc25CG during prophase"EMBO Reports. (in press). (2002)
• [Publications] Bamba, C., Bobinnec, Y., Fukuda, M., Nishida, E.: "The GTPase Ran regulates chromosome positioning and nuclear envelope assembly in vivo"Curr. Biol.. (in press). (2002)
• [Publications] Akashi, M., Tsuchiya, Y., Yoshino, T., Nishida, E.: "Control of intracellular dynamics of mammalian Period proteins by casein kinase Iε (CKIε) and CKIδ in cultured cells"Mol.Cell.Biol.. 22. 1693-1703 (2002)
• [Publications] Matsubayashi, Y., Fukuda, M., Nishida, E.: "Evidence for existence of a nuclear pore complex-mediated, cytosol-independent pathway of nuclear translocation of ERK MAP kinase in permeabilized cells"J.Biol.Chem.. 276. 41755-41760 (2001)
• [Publications] Hoque, T., F.Ishikawa.: "Human chromatid cohesin component hRad2l is phosphorylated in M phase and associated with metaphase centromeres"J.Biol. Chem.. 276. 276
• [Publications] Ohki, R., T.Tsurimoto, F.Ishikawa.: "In vitro reconstitution of the end-replication problem"Mol. Cell. Biol.. 21. 5753-5766 (2001)
• [Publications] Kuramoto, M., K.Ohsumi., T.Kishimoto, F.Ishikawa.: "Identification and analyses of the Xenopus TELRT gene that encodes the catalytic subunit of telomerase"Gene. 277. 101-110 (2001)
• [Publications] Kanoh, J., F.Ishikawa.: "SpRap1 and spRifi, recruited to telomeres by Taz1, are essential for telomere function in fission yeast"Curr.Biol.. 11. 1624-1630 (2001)