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2013 Fiscal Year Annual Research Report

人工ヌクレアーゼを用いた標的遺伝子組換えメダカ作出技術の確立

Research Project

Project/Area Number 13J01682
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

安齋 賢  京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)

Keywordsメダカ / ゲノム編集 / ヌクレアーゼ / 標的遺伝子組換え / TALEN / CRISPR/Cas
Research Abstract

ゲノム情報の整備が急速に進む現在、個々の遺伝子の機能を個体レベルで詳細に解析するために、逆遺伝学的手法の重要性が増大している。本研究では、任意のゲノムDNAを切断可能な人工ヌクレアーゼを用いて、メダカにおける標的遺伝子組換え技術を確立することを目的とした。本年度は、作製したヌクレアーゼの活性評価や変異体作出を簡便・高効率に行うため、次の3点に取り組んだ。
1. マイクロチップ電気泳動装置を用いた変異検出方法の改良 : 標的配列を含む短鎖PCR産物の電気泳動による変異解析手法(Heteroduplex Mobility Assay)とマイクロチップ電気泳動装置と組み合わせて用いることで、より迅速かつ簡便な変異検出方法の確立に成功した。
2. ヌクレアーゼ標的配列による導入変異の偏りの解析 : 複数のTAL Effector Nuclease (TALEN)における変異配列解析によって、TALEN切断箇所を挟んで存在する3から6塩基程度の2つの相同配列間で、特定の欠失変異配列が高頻度に出現することを発見した。
3. CRISPR/Casシステムのメダカにおける有効性の検討 : RNA誘導型エンドヌクレアーゼとして機能するCRISPR/Casシステムのメダカの標的遺伝子破壊において有効であることを示した。さらに、single guideRNA (sgRNA)の5'側の構造を比較検討することで、比較的自由に標的配列を選択できることを示した。一方で、一部のsgRNAによって標的配列に類似したゲノム中の配列(off-target)が切断されることが明らかとなった。
これらの成果から、人エヌクレアーゼを用いた標的遺伝子破壊はメダカにおいて容易に使用可能な技術となりつつある

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初使用を計画していたTALENに加えて、新たにCRISPR/Casシステムが登場しそのメダカへの適用に成功したことで、メダカ初期胚内における変異導入効率は大幅に向上した。この結果は当初の予想を遥かに上回るものであり、標的組換え実験への成功に向けて大きく前進したと考えられ. 。

Strategy for Future Research Activity

人工ヌクレアーゼによるGFP等のレポーター遺伝子を含む遺伝子断片の標的箇所への導入実験を行う。既に同じ小型魚類であるゼブラフィッシュにおいて、相同組換え非依存的な遺伝子断片の標的導入の成功が報告されていることから、そのデータを参照にして実験に取り組む予定である。

  • Research Products

    (8 results)

All 2014 2013 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results) Presentation (4 results) (of which Invited: 4 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka2014

    • Author(s)
      Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
    • Journal Title

      Biology Open

      Volume: 3 Pages: 362-371

    • DOI

      10.1242/bio.20148177

    • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Design, evaluation, and screening methods for efficient targeted mutage nesis with TALENs' in medaka.2014

    • Author(s)
      S. Ansai, K. Inohaya, Y. Yoshiu ra, M. Schartl, N. Uemura, R. Takahashi, M. Kinoshita
    • Journal Title

      Development, Growth & Differentiation

      Volume: 56 Pages: 98-107

    • DOI

      10.1111/dgd.12104

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] CRISPR/Cas system-an efficient and simple tool for targeted genome editing in medaka2013

    • Author(s)
      S. Ansai, M. Kinoshita
    • Organizer
      19th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
    • Place of Presentation
      仙台市情報・産業プラザ(宮城県仙台市)
    • Year and Date
      20130920-21
    • Invited
  • [Presentation] CRISPR/Casシステムを利用したメダカにおける簡便・高効率な標的遺伝子破壊2013

    • Author(s)
      安齋賢, 木下政人
    • Organizer
      第36回本分子生物学会年会
    • Place of Presentation
      神戸国際展示場(兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2013-12-05
    • Invited
  • [Presentation] TALEN及びCRISPR/Casを用いた標的遺伝子破壊メダカ作出技術の開発2013

    • Author(s)
      安齋賢, 木下政人
    • Organizer
      第10回水生動物の行動と神経系シンポジウム
    • Place of Presentation
      鹿児島大学理学部(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2013-11-30
    • Invited
  • [Presentation] CRISPR/Casシステムによる遺伝子破壊メダカの作出2013

    • Author(s)
      安齋賢, 木下政人
    • Organizer
      日本動物学会第84回岡山大会
    • Place of Presentation
      岡山大学津島キャンパス(岡山県岡山市)
    • Year and Date
      2013-09-27
    • Invited
  • [Book] 実験医学別冊 最強のステップUPシリーズ今すぐ始めるゲノム編集TALEN&CRISPR/Cas9の必須知織と実験プロトコール2014

    • Author(s)
      山本卓, 佐久間哲史, 落合博, 木下政人, 安齋賢, 久野悠, 川原敦雄, 他(計45名)
    • Total Pages
      205
    • Publisher
      羊土社
  • [Remarks] 研究者代表者個人ホームページ

    • URL

      http://www.mbf.marine.kais.kyoto-u.ac.jp/~ansai/cv.html

URL: 

Published: 2015-07-15  

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