2014 Fiscal Year Annual Research Report
光依存型酵素の構造改変による新規光反応への機能変換
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13J02354
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山本 治樹 大阪大学, 蛋白質研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 光合成 / クロロフィル / 酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の対象である光依存型Pchlide還元酵素LPORのX線結晶構造解析については良質な回折データを得るため初期スクリーニングを行っている段階である。本年度はLPORの後の反応を触媒する酵素、クロロフィリドa還元酵素(COR)について特筆すべき研究結果を上げたので、それについて述べる。
・DPORとCORによる連続反応の再構成
光合成細菌Rhodobacter capsulatusのバクテリオクロロフィル生合成後期の反応に２つの酵素DPORとCORが連続して触媒する反応が存在する。DPORは本研究課題で構造解析を目指しているLPORと同じ反応を触媒する酵素でニトロゲナーゼという窒素固定酵素と有意な相同性を持つ。CORもDPORと同様にニトロゲナーゼに有意な相同性をもち、これら２つのニトロゲナーゼ類似酵素が連続して反応することについては非常に興味深い現象であると考えられてきた。今回、これら２種類の活性型の酵素を精製し、この連続反応をin vitroで再構成することに成功した。この再構成実験により、最近発見されたCORの第二の活性である8V-Chlideの8位のビニル基還元活性が確認され、それぞれの酵素学的な性質を比較し生体内でどのように協調して反応を進めているか考察を行った。
・CORの持つ2種類の還元活性の個別評価系の確立
前述のようにCORは8V-Chlideに対して8位のビニル還元とB環の炭素二重結合の還元の二種類の活性を保持する珍しい酵素である事が分かった。これまでのCORの研究はB環還元に焦点を当てており、CORによる8位のビニル基還元反応はどのような酵素学的パラメータを持つ反応なのか、全く分かっていなかった。そこで私はCORを大量精製し活性測定する実験系を応用し、CORのビニル基還元について生化学的なアプローチを行いその解析をすることを試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
光依存型プロトクロロフィリド還元酵素LPORの構造解析に向け、様々な方向からアプローチを試みた。現在のところ再現性良く良質な結晶が得られる条件は見つかっていないが、精製LPORの収量やより安定なLPORの発現系も検討しており今後の展開に期待される。またLPORと並行して進めているクロロフィリド還元酵素CORの構造解析、生化学解析において新しい知見を得た。精製および活性測定の困難なCORの生化学解析に成功し、新規活性についてその詳細な解析を行った。またCORの全複合体であるX-YZ複合体(-360kDa)の調製にも成功し、それを用いた結晶化スクリーニングにも期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
LPORの結晶化スクリーンについては、さらなる条件の探索を進めるとともに、より安定な蛋白質をコードすると考えられる好熱性の生物からのクローニングを行っていく。また昨年度に引き続き結晶化しやすい蛋白質との融合蛋白質としてLPORを結晶化する方法も継続する。
昨年度において進展のあったCORの生化学的解析、および構造解析について本格的に進めていく。CORの生化学的解析については通常の基質であるMV-chlorophyllide a以外にDV-chlorophyllide a という基質を用いてその新規活性についてさらなる解析を進めて行く。また光合成細菌Rhodobacter capsulatusとBlastochloris viridisにおいてCORの活性、触媒機能が異なる事も発見されたため、これらの活性の違いがどのような構造因子によるものなのかを明らかにするためにこれら２種類のCORについてX線結晶構造解析を試みる。これらの蛋白質の発現系はおおよそ完成しているので、これらの精製手法の最適化および結晶化のスクリーニングを進める。
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