2014 Fiscal Year Annual Research Report
染色体の複製・分配とミトコンドリア・葉緑体の分裂・分配に共通する制御機構の解明
| Project/Area Number |
13J03172
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Genetics |
|---|
Principal Investigator |
藤原 崇之 国立遺伝学研究所, 新分野創造センター, 特別研究員(PD)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 葉緑体 / ミトコンドリア / 細胞周期 / 藻類 / 形質転換 / コンデショナルノックダウン / 遺伝子発現誘導系 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
染色体と葉緑体・ミトコンドリアに共通する分配制御機構を解明するため、研究材料として単細胞紅藻シアニディオシゾン（以下シゾンと略す）を用いた。シゾンはミトコンドリアと葉緑体を1つずつ持つ単純な細胞内構造をしている。全ゲノムの塩基配列が解読されており、相同組換えによる遺伝子ターゲッティング法を始め、種々の遺伝子工学的手法が開発されてきた。シゾンのミトコンドリアと葉緑体は細胞核のDNA合成期に分裂し、染色体の分配と同時に娘細胞へと分配されていく。このような現象を解明するために、解析対象遺伝子に対する逆遺伝学的なアプローチが有効であるが、細胞の増殖に直接関わる遺伝子の欠損は致死になる可能性が高いため、解析不能である。そこで、平成26年度はシゾンにおいてコンディショナルノックアウト系を開発することを目指した。硝酸同化に関わる遺伝子の発現が、アンモニウム存在下において抑制されることに注目し、硝酸還元酵素(NR)、亜硝酸還元酵素(NIR)及び硝酸トランスポーター(NRT）の上流領域800bpをプロモーターとしてGFP遺伝子を発現させる株を作成し、それらのプロモーター活性を調べた。どのプロモーターも硝酸培地ではGFPの発現が誘導され、培養液にアンモニウムを添加すると急速にそして極度に発現が抑えられることを確認した。硝酸培地中における3つのプロモーターはNR、NRT、NIRの順に強く、その強さは大きく異なった。したがって、このコンディショナルノックダウン系を解析対称遺伝子に応用する場合には、その発現量に合わせてプロモーターを選択することが重要であると考えられた。解析対象遺伝子の発現量は既に得られている細胞周期もしくは指数対数増殖期のマイクロレイ解析の結果を参考にすることが出来る。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞核の染色体の複製・分配と共通したミトコンドリアおよび葉緑体の分裂・分配の制御機構を解析するための重要な手段は、候補遺伝子の機能を欠損させることであるが、この方法は生育に必須な遺伝子には適用できなかった。平成２６年度にはこの問題を解決するため、単細胞紅藻C. merolaeにおいて培地中の窒素源を変換することで条件的に遺伝子発現を抑える系を構築した。この方法を候補遺伝子の解析に用いることで、上記制御機構に解析が進むと考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
細胞核の染色体の分配と共通したミトコンドリアおよび葉緑体の分配の制御機構を解析する。研究材料は単細胞紅藻C. merolaeを用いる。窒素源の変換によるコンデショナルノックダウン系を候補遺伝子に適用し解析する。候補遺伝子には、まず染色体の分配の制御に関して重要な役割を持つことが知られている各種サイクリン/CDK、Poloキナーゼ、Auroraキナーゼが挙げられる。次に染色体やミトコンドリアおよび葉緑体の分配に直接関与する微小管の関連因子である各種キネシンやtubulin folding cofactor等が考えられる。これらの遺伝子のコンデショナルノックダウンを行い、染色体およびミトコンドリア・葉緑体の動態を解析する。また各種キナーゼに関しては、開発されているヒートショック誘導系を用いて、分配の時期特異的にドミナントネガティブ変異体を発現させて、表現型を解析する。分配に関する欠損が生じた遺伝子について、抗体作成またはGFPタグもしくはHAタグ融合タンパク質の安定発現株を作成する。タンパク質の局在解析を行って、どのように染色体とミトコンドリアおよび葉緑体の分配に関与するのかを解析していく。
|
Research Products
(5 results)
