キチン系バイオマスの有効利用をめざした構造生物学：キトサン加水分解酵素

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J03639
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 新家 粧子 近畿大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 糖質結合モジュール / キチン / キトサン / キトサナーゼ / NMR溶液構造

Outline of Annual Research Achievements

真菌類細胞壁に含まれるキチンおよびキトサンの有効利用を促進するため、構造生物学的手法によりキトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール（DD1,DD2）の立体構造を明らかにし、キトサン認識機構を解明することを目的とした。DD1およびDD2の立体構造は、核磁気共鳴(NMR)法を用いた溶液構造解析により明らかにした。大腸菌発現系を用いて得られた13Cおよび15NラベルDD1、DD2を用い、1H-15N HSQCおよび3次元スペクトルの測定を行い、主鎖シグナルの帰属を行った。つづいて、1H-13C HSQC、HCCH-TOCSY、CCH-TOCSYの測定を行い、側鎖シグナルの帰属を行った。さらに、NOESYスペクトルの測定を行い、NOEを帰属し、CYANAプログラムによって構造計算を行った。その結果、DD1とDD2ともに、2枚のbetaシートからなるbetaサンドウィッチ構造を有し、その上下に突き出すようにいくつかのループ構造が存在することが明らかになった。さらにNMRを用いたキトサンオリゴ糖の滴定実験の結果、キトサンはDD1とDD2のbetaサンドウィッチ構造の上部のループ領域に結合することがわかった。また、結合に関与するアミノ酸残基の比較を行ったところ、DD１の36番目のグルタミン酸残基がDD2ではチロシン残基に置換していることがわかった。そこで、このアミノ酸残基について、DD1のグルタミン酸残基をチロシンに変異させたDD1-E36Yおよび、DD2のチロシン残基をグルタミン酸に変異させたDD2-Y36Eを作製し、キトサン結合実験を行った結果、DD1ではGlu36のチロシンへの変異が親和性大きく低下させ, また, DD2のTyr36のグルタミン酸への変異が親和性の増大をもたらした。以上のように、部位特異的変異によってCBMのリガンド特異性のコントロールが可能であることが示唆された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Interaction of di-N-acetylchitobiosyl moranoline with a family GH19 chitinase from moss, Bryum coronatum. (2014)
  • Author(s): Shinya, S., Urasaki, A., Ohnuma, T., Taira, T., Suzuki, A., Ogata, M., Usui, T., Lampela, O., Juffer, AH., Fukamizo, T.
  • Journal Title: Glycobiology Volume: 24 Pages: 945-955
  • DOI: 10.1093/glycob/cwu052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of a “loopless” GH19 chitinase in complex with chitin tetrasaccharide spanning the catalytic center. (2014)
  • Author(s): Ohnuma, T., Umemoto, N., Nagata, T., Shinya, S., Numata, T., Taira, T., Fukamizo, T.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1844 Pages: 793-802
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2014.02.013.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutation strategies for obtaining chitooligosaccharides with longer chains by transglycosylation reaction of family GH18 chitinase. (2014)
  • Author(s): Sirimontree, P., Suginta, W., Srinrho, N., Kanda, Y., Shinya, S., Ohnuma, T., Fukamizo, T
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 78 Pages: 2014-2021
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.948373.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Chitosan-binding modules (CBM32) of a chitosanase from Paenbacillus sp. IK-5 (2014)
  • Author(s): Shoko Shinya, Shigenori Nishimura, Hisashi Kimoto, Hideo Kusaoke, Takayuki Ohnuma, Tamo Fukamizo
  • Organizer: Mie Bioforum 2014
  • Place of Presentation: Ise-Shima, Japan（三重県志摩市）
  • Year and Date: 2014-11-19
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5 キトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール (DD1)のNMR溶液構造とキトサン結合に関与するアミノ酸残基 (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 日本応用糖質科学会平成26年度大会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2014-09-24
• [Presentation] オリゴ糖結合がキトサン結合モジュールの熱安定性へ及ぼす影響 (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 第28回キチン・キトサンシンポジウム
  • Place of Presentation: 順天堂大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2014-08-07
• [Presentation] Chitosan-binding modules (CBM32) of a chitosanse from Paenbacillus sp. IK-5 --- Amino acid residues responsible for chitosan binding--- (2014)
  • Author(s): Shoko Shinya, Takayuki Ohnuma, Hisashi Kimoto, Hideo Kusaoke, Tamo Fukamizo
  • Organizer: 28th annual symposium of the protein society
  • Place of Presentation: SanDiego, USA
  • Year and Date: 2014-07-28
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5 キトサナーゼのCBM32キトサン結合モジュール－リガンド結合に関与するアミノ酸残基－ (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、西村重徳、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 第15回関西グライコサイエンスフォーラム第15回関西グライコサイエンスフォーラム
  • Place of Presentation: 大阪市立大学（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2014-05-24