クロマチン構造上における減数分裂期組換えの分子機構

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J03652
• Research Institution: Waseda University
• Principal Investigator: 小林 航 早稲田大学, 理工学術院, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 減数分裂期組換え / DMC1 / RAD51 / クロマチン / 組換えホットスポット / 相同鎖検索 / 相同的対合反応

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、RAD51及びDMC1の機能差異を明らかにし、減数分裂期組換えの分子機構を解明することを目的とする。本年度は、遺伝学的解析が進められているイネRAD51に着目し、その生化学的解析を行った。とりわけ、C末端にGFPを付加したRAD51-GFPに焦点を当てた。先行研究において、RAD51-GFPは体細胞における相同組換え修復を阻害するが、減数分裂期組換えには影響しないことが報告されている。このことは、RAD51-GFPは相同組換え修復に対して阻害的に働くことを示唆しているが、その分子機構は明らかでない。そこで、イネRAD51-GFPをリコンビナントタンパク質として精製し、その生化学的解析を行った。解析の結果、C末端に結合したGFPはRAD51-単鎖DNA複合体の二重鎖DNAへの結合を阻害するために、相同組換え修復に対して阻害的に働くことが明らかになった。減数分裂期組換えでは、RAD51に加えてDMC1が働いている。RAD51は体細胞の相同組換え修復における中心的酵素であるが、減数分裂期組換えにおいてはDMC1の組換え活性を促進する補助因子としての役割を担う。そこで、イネDMC1とRAD51-GFPの両存在下における相同的対合反応を解析した。解析の結果、RAD51-GFPはDMC1が触媒する相同的対合反応を促進した。以上の解析より、RAD51-GFPはそれ自体の組換え活性を失っているもものの、減数分裂期組換えにおけるDMC1の補助因子としての機能を保持していることを明らかにした。並行して、HeLa細胞を用いたゲノムワイドな局在解析を行い、クロマチン構造上におけるRAD51とDMC1の機能差異に関する重要な知見を得た。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

減数分裂期組換えの分子機構を解明するために、本年度はRAD51-GFPを用いた生化学的解析を行った。RAD51-GFPの解析により、減数分裂期組換えにおけるDMC1とRAD51の機能差異に関する重要な知見を得た。さらに、HeLa細胞を用いたRAD51とDMC1の局在解析を行い、クロマチン構造上における両者の機能差異に関する知見を得ている。そのため、研究計画以上に研究が進展したと言える。

Strategy for Future Research Activity

再構成クロマチンを用いた試験管内における解析より、RAD51とDMC1のヌクレオームに対する結合性が異なることをこれまでに明らかにしてきた。しかしながら、実際の生体内では、減数分裂期特異的な染色体構造であるシナプトネマ複合体中で減数分裂期組換えが進行する。そのため、今後はシナプトネマの構成因子がRAD51とDMC1の組換え反応に与える影響を明らかにしていく必要がある。

Research Products

• [Journal Article] Nap1 stimulates homologous recombination by RAD51 and RAD54 in higher-ordered chromatin containing histone H1. (2014)
  • Author(s): Machida, S., Takaku, M., Ikura, M., Sun, J., Suzuki, H., Kobayashi, W., Kinomura, A., Osakabe, A., Tachiwana, H., Horikoshi, Y., Fukuto, A., Matsuda, R., Ura, K., Tashiro, S., Ikura, T., and Kurumizaka, H.
  • Journal Title: Scientific Rep. Volume: 4 Pages: 4863
  • DOI: 10.1038/srep04863.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Green fluorescent protein fused to the C-terminal end of RAD51 specifically interferes with secondary DNA binding by the RAD51-ssDNA complex. (2014)
  • Author(s): Kobayashi, W., Sekine, S., Machida, S., and Kurumizaka, H.
  • Journal Title: Genes Genet. Syst. Volume: 89 Pages: 169-179
  • DOI: 10.1266/ggs.89.169.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Biochemical analysis of DMC1-medited homologous pairing in chromatin (2014)
  • Author(s): Wataru Kobayashi, Motoki Takaku, Shinichi Machida, Hiroaki Tachiwana, Yasuyuki Ohkawa, Hitoshi Kurumizaka
  • Organizer: The 9th 3R Symposium
  • Place of Presentation: Goten Kogen Hotel Tokinosumika, Japan
  • Year and Date: 2014-11-17 – 2014-11-21
• [Presentation] クロマチンにおける減数分裂期特異的相同組換え酵素DMC1の機能解析 (2014)
  • Author(s): 小林 航, 高久 誉大, 町田 晋一, 立和名 博昭, 大川 恭行, 胡桃坂 仁志
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [Presentation] FUNCTIONAL ANALYSES OD RAD51 AND DMC1 RECOMBINASES IN RICE (2014)
  • Author(s): Wataru Kobayashi, Shinichi Machida, and Hitoshi Kurumizaka
  • Organizer: Plant Genome Stability and Change 2014
  • Place of Presentation: Pacific Grove, California, USA
  • Year and Date: 2014-07-17 – 2014-07-21