2014 Fiscal Year Annual Research Report
ＰＰＲ蛋白質を利用した標的ＲＮＡ特異的改変システムの開発
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13J04569
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
八木 祐介 九州大学, 農学研究院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | RNA / PPR / ヌクレアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、配列特異的にRNAと結合するPPRモチーフを利用して、狙ったRNAを特異的に分解するような蛋白質性分子の開発を行っている。本年度は、配列特異性といったRNA結合性能を評価する系の確立を中心に行った。一般的に利用されているIRESベクターのIRES配列をPPR結合配列に置換しPPRがRNAに結合した場合のみ、2nd ORF（FLUC）の翻訳が活性化されるような系を考案した。まず、翻訳活性化が期待された蛋白質と天然型PPR蛋白質との融合蛋白質発現ベクターを作成した。それとレポータープラスミドをHEK293T細胞に共導入しルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、いくつかの融合PPR蛋白質において、FLUC翻訳活性の上昇が標的配列特異的に見られた。次に、結合配列を設定し、それを標的する人工PPR蛋白質を設計し作成した。上記のアッセイシステムを用いて結合性を解析した結果、標的配列特異的に強い翻訳活性化が見られた。さらにこの系を利用することで、オフターゲット効果やモチーフ数による結合性能の変化などを解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、PPRモチーフを並べたRNA認識モジュールの作成手法の確立と、RNA分解のためのエフェクターモジュール開発の２つの課題がある。初年度はまずPPR-RNA結合評価システムの確立を目標にした。RNA-PPR結合をレポーター系で検出するために、Bi-cistronic reporterを利用したアッセイ方法を構築した。その結果、非常に簡単に、作成したカスタムPPRの評価ができるようになった。さらに、実際に任意配列に結合する人工PPR蛋白質の作成に成功した。よって、初年度の目標は概ね達成されており、次の目標であるRNA分解ドメインを融合した人工リボヌクレアーゼの開発に進めると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究で塩基認識モジュールについては一定の結果を示せたので、次年度はエフェクターモジュールの開発に重点を置く。まずは、既知のリボヌクレアーゼ、RNA分解ドメインをPPRと融合し、レポーターアッセイにより機能するドメインのスクリーニングを行う。その後、分解効率、切断部位、特異性などを細胞内で実際に発現しているRNAを対象に調べる。これらの研究は当初植物オルガネラを標的としていたが、動物培養細胞系に変更し、人工リボヌクレアーゼ開発のスピードアップを目指す。
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