マウス始原生殖細胞におけるチミンDNAグリコシラーゼ(TDG)の機能解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J05081
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 三谷 忠宏 京都大学, 医学研究科, 特別研究員
• Keywords: DNA脱メチル化 / 始原生殖細胞 / チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)

Research Abstract

本度目は、TDGのCre-loxP systemを用いた条件付きノックアウトアレルを持ったES細胞を作成した。相同組換えES細胞をPCRを用いてスクリーニングするためのポジティブコントロールとして、ターゲィングベクターよりも長い3'側ホモロジーアームを持つベクターを作成し、PCRの条件検討を行った。また相同組換えを高精度で検出するためのサザンハイブリダイゼーションに用いるプローブを設計した。次に、ターゲティングベクターを作成し、理化学研究所発生・再生科学総合研究センター動物資源開発室との共同研究により組み換えES細胞の単離を行い、組み換えES細胞のスクリーニングとkaryotypeの確認を行っている。尚、本計画の相同領域は20kbp以上の広範囲にわたっており、相同組換えES細胞が得られる確率が低いことが予測される。このため、研究の補助としてEUCOMMより条件付きノックアウトアレル(ただしノックアウトによる細胞の蛍光標識は不可となる)を持ったES細胞の購入を検討している。
上記研究に加え、マウス始原生殖細胞(PGCs)におけるエピゲノム初期化の分子学的基盤のさらなる解明のために、PGCs発生に必須の転写因子の一つであるBlimp1によるエピゲノム制御の解析を新たに計画している。具体的には、エピゲノム初期化がみられる受精後12.5日マウス胚のPGCsにおけるBlimp1のゲノム上の結合部位を、クロマチン沈降法を用いて明らかにする。これにより得られた結合部位と、より早期のPGCs決定期におけるBlimp1の結合部位、およびBlimp1を発現する他臓器(形質細胞等)におけるBlimplの結合部位を比較し、PGCsにおけるBlimp1の特性を抽出することを目的とする。現在、クロマチン沈降法の条件検討を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画に従い組み換えES細胞の作成を行っている段階である。またマウス始原生殖細胞におけるエのピゲノム初期化のさらなる分子基盤の解明のためのBlimp1の免疫クロマチン沈降法についても条件が決まりつつあるところである。

Strategy for Future Research Activity

TDGの条件付きノックアウトマウスの作成を進め、またBlimp1のPGCsにおける結合部位を同定し、PGCsにおけるエピゲノム初期化の分子学的基盤の解明を目指す。