2014 Fiscal Year Annual Research Report
ラマン分光法によるＡｌｚｈｅｉｍｅｒ病凝集タンパク質の定量的測定技術の開発
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13J06016
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
長島 優 東京大学, 医学部附属病院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2013-04-26 – 2016-03-31
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| Keywords | アミロイドβ / ラマン分光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．振動スペクトル測定装置の構築：分光装置の光源として、新たに785nmのECDL(external cavity diode laser)モジュールを自作した。また、レーザー発振を安定化させるために必要な定電流ドライバおよび温度コントローラを自作した。製作したECDL光源を顕微鏡に組み込み、レーザーラマン分光顕微鏡を製作した。光源から出た連続波レーザーを対物レンズでサンプルに集光した後、フィルターで光源波長をカット、長波長側のラマン散乱光のみを冷却CMOS付分光器に導き、ラマンスペクトルを測定する。
2. アルツハイマー病剖検脳の振動スペクトル測定系の構築：アルツハイマー病剖検脳の凍結切片を抗アミロイドβマウスモノクローナル抗体で免疫染色し、染色性を認めた部位(老人斑)での振動スペクトル測定系を構築した。in vitroのAβ凝集体で特徴的だった1449cm-1, 1656cm-1のピークは剖検脳中の老人斑では目立たなかった。抗Aβ抗体で染色性を認める老人斑と、染色性を認めない脳組織のスペクトルの比較からは、1473cm-1のピーク(点線矢印)が老人斑に特徴的な可能性が考えられた。
3. 組織中での振動スペクトル測定技術の開発：測定した免疫染色試料上の老人斑の振動スペクトルは、in vitroのAβ凝集体のスペクトルと異なる。この原因として、免疫染色後の試料の自家蛍光が、相対的に弱いラマン散乱光のスペクトル構造の観測を困難にしている可能性が考えられた。この可能性を排除するためには、非染色試料の振動スペクトル測定後に免疫染色を行い、老人斑のある画素でのスペクトルを確認する必要がある。現在、染色操作前後に標本上の同じ場所を定位するための位置あわせの画像処理プログラムを製作している。
4. 培養細胞でのアミロイドβ凝集系の構築：高濃度Matrigelを用いて間質の拡散係数を下げ、培養細胞にアミロイド凝集体を作らせる系の構築を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
アルツハイマー病剖検脳の組織中で老人斑の振動スペクトルを測定できる実験系を構築した。また免疫染色試料上の老人斑で、実際に振動スペクトルを測定し、先にin vitroで測定していたアミロイドβ凝集体の振動スペクトルとの比較・考察を行った。
本来、振動スペクトル測定は非染色の試料を対象とする。組織中の振動スペクトルの空間分布を測定し、既存の染色方法を用いた標本の染色性との比較を行うためには、染色操作前後で撮影した顕微鏡画像を位置あわせする画像処理技術が必要になる。このためのプログラムも自作し、性能評価を行っている。
培養細胞系でアミロイドβ凝集体の振動スペクトル測定を行う系は、構築中である。
さらに今年度は、新たに測定のための振動スペクトル測定装置を一から自作した。施設共用の装置を使った測定は確保できるマシンタイムが限られることが、研究を進める上でのボトルネックになっていたが、今後、培養細胞・脳組織中でのアミロイドβ凝集体の観測に向けて、研究のスピードアップが期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞系でアミロイドβ凝集体の振動スペクトル測定を行う系を構築し、測定結果をin vitroや剖検脳のスペクトルと比較する。
アミロイドβの凝集反応について、測定した振動スペクトルの空間分布の情報から考察を行う。
測定を進めていく中で、組織標本の測定では、自家蛍光が背景信号なって、測定信号に重畳することからS/N比が損なわれることがかなりあることが分かってきており、自発ラマン散乱光の定量性を担保できるかどうかが、問題となる可能性が出てきた。
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