ブタキメラ技術を基盤とした移植・再生医療に関する研究

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13J06509
• Research Institution: Meiji University
• Principal Investigator: 中野 和明 明治大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
• Keywords: 異種キメラ / 胚盤胞補間法 / ブタ / 体細胞核移植 / 臓器再生 / キメラ形成能

Research Abstract

本課題はこれまで確立したブタの体細胞クローニングシステムとキメラブタ作出法を土台に、(1)多能性幹細胞のキメラ形成能を検証するシステムの確立、(2)ブタ胚をホストとする異種キメラ作出の可能性を検証、(3)胚盤胞補完により多能性幹細胞による欠損臓器の修復の可能性の検証が目的である。本年度は(1)、(2)について取り組んだ。多能性幹細胞をブタ単為発生胚由来の割球と凝集させることで、簡便に多能性幹細胞のキメラ形成能をin vitro及びin vivoで検証出来るシステムを確立した(Nakano et al 2013, Plos one)。本法は共同研究者が樹立したブタiPS細胞の多分化能の検証にも利用することが可能であった(Arai et al, 2013, Genesis)。ブタ単為発生胚を用いた凝集法を異種間キメラに応用し、ブタ胚と異種胚細胞の親和性を検証した。ドナー細胞にはブタと同じ偶蹄類であるウシと霊長類であるマーモセットを用いた。まず、割球同士の凝集胚を作製し、胚盤胞への発生率、異種細胞の挙動を検証した。異種間凝集胚は、ブタ同種凝集胚と同様の効率で胚盤胞に発生し得ることが明らかとなった。得られた胚盤胞におけるドナー細胞の分布、すなわちキメリズムは、ICMだけでなく栄養膜細胞にも高頻度に及んでいた。次に、ICMをドナー細胞に用いて異種間凝集胚におけるキメリズムの発生を検証したところ、ウシICM、マーモセットICMをドナー細胞とする凝集胚は、高効率にキメラ胚盤胞に発達することが明らかとなった。ウシICMを用いて作製したウシブタキメラ胚盤胞を仮腹雌に外科的に移植したところ、体節期胎仔(day20)においてキメラ状態が維持されることが明らかとなった。本成果はブタ体内における異種臓器再生(最終的にはヒト)という究極的な目標に向けて、重要な知見であると考える。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の目的は(1)多能性幹細胞のキメラ形成能を検証するシステムの確立、(2)ブタ胚をホストとする異種キメラ作出の可能性を検証することである。PLOS ONE誌に発表したキメラブタの作出法は、ブタiPS細胞やES細胞の多能性評価システムとして非常に有効であり、実際、共同研究者が樹立したブタiPS細胞の多分化能の検証においても重要な役割を果たし、その成果の一部はGenesis誌に掲載された。また、異種キメラにおいても発生初期胎仔においてキメラ状態が維持出来るという知見を得たことから、概ね順調に研究計画は進展していると評価する。

Strategy for Future Research Activity

当初の計画の通り、ZFNによるブタ初代培養細胞の遺伝子KO(候補はSall1, Il2RG)を行う。得られたKO細胞を体細胞クローニングに用いて、KOクローンブタを作出する。得られたクローン胎仔あるいは産仔における表現形や他の異常の有無について詳細に解析する。腎臓または胸腺の欠損の表現形が確認されたら、その個体の細胞からクローン胚を得て、その胚盤胞補完により欠損臓器の修復が可能か否かを調べる。補完には同種胚細胞の他、開発状況を見ながら、ブタiPS細胞を用いる。

Research Products

• [Journal Article] Generating porcine chimeras using inner cell mass cells and parthenoge netic preimplantation embryos. (2013)
  • Author(s): Nakano K, Watanabe M, Matsunari H, Matsuda T, Honda K, Maehara M, Kanai T, Hayashida G, Kobayashi M, Kuramoto M , Arai Y, Umeyama K, Fujishiro S, Mizukami Y, Nagaya M, Ha nazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0061900
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of interleukin-2 receptor gamma gene knockout pigs from so matic cells genetically modified by zinc finger nuclease-encoding mRNA. (2013)
  • Author(s): Watanabe M, Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Maehara M, Kanai T, Kobayashi M, Matsumura Y, Sakai R, Kuramoto M, Hayashida G, Asano Y, Takayanagi S, Arai Y, Umeyama K., Nagaya M, Hanazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0076478
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] DNA methylation profiles provide a viable index for porcine pluripotent stem cells. (2013)
  • Author(s): Arai Y, Ohgane J, Fujishiro S. Nakano K, Matsunari H, Watanabe M, Umeyama K, Azuma D, Uchida N, Sakamoto N, Makino T, Yagi S, Shiota K, Hanazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: Genesis Volume: 51 Pages: 763-776
  • Peer Reviewed
• [Presentation] In vivo exogenic organ generation with organogenesis-disabled cloned pigs as a platform (2014)
  • Author(s): Matsunari H, Nakano K, Kanai T, Matsuda T, Maehara M, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nakauchi H, Nagashima H
  • Organizer: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • Place of Presentation: Reno, USA
  • Year and Date: 20140111-14
• [Presentation] Practical application of the hollow fiber vitrification method for cryopres ervation of mammalian embryos (2014)
  • Author(s): Uchikura A, Wakayama T, Wakayama S, Matsunari H, Maehara M, Matsumura Y, Nakano K, Sasaki E, Okahara J, Tsuchiya H, Nakauchi H, Nagashima H
  • Organizer: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • Place of Presentation: Reno, USA
  • Year and Date: 20140111-14
• [Presentation] Application of blastocyst complementation to development of genetically modified pigs for xenotransplantation (2013)
  • Author(s): Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Kanai T, Hayashida G, Matsumura K, Kobayashi M, Kuramoto M, Asano Y, Sakai R, Uchikura A, Arai Y, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nagashima H
  • Organizer: 12th Congress of International Xenotransplantation Association (IXA)
  • Place of Presentation: Osaka
  • Year and Date: 2013-11-13