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2015 Fiscal Year Annual Research Report

無細胞翻訳系を用いたSecYEGトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

Research Project

Project/Area Number 13J06852
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

松林 英明  東京大学, 新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC1)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords無細胞翻訳系 / PURE system / SecYEG / タンパク質膜透過 / liposome / GUV / 1分子観察 / 全反射顕微鏡
Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの1分子観察を行った。
脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。
SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で1分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して1分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから1分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

  • Research Products

    (4 results)

All 2016 Other

All Presentation (2 results) (of which Invited: 1 results) Remarks (2 results)

  • [Presentation] 無細胞翻訳系によるSecYEGトランスロコンの合成と解析2016

    • Author(s)
      松林英明
    • Organizer
      生化学若い研究者の会 関東支部 Biological Science Graduate Seminar
    • Place of Presentation
      御茶ノ水女子大学本館103会議室
    • Year and Date
      2016-03-20 – 2016-03-20
    • Invited
  • [Presentation] In Vitro Synthesis of SecYEG Translocon2016

    • Author(s)
      松林英明
    • Organizer
      ソフトマター若手勉強会
    • Place of Presentation
      東京大学検見川セミナーハウス
    • Year and Date
      2016-03-10 – 2016-03-11
  • [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩(東京大学 新領域創成科学研究科 ニュース)

    • URL

      http://www.k.u-tokyo.ac.jp/info/entry/22_entry315/

  • [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩(東工大ニュース)

    • URL

      http://www.titech.ac.jp/news/2014/028029.html

URL: 

Published: 2016-12-27  

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